【背景介绍】
合成水凝胶作为支架在体外模拟细胞的3D微环境而受到关注。各种交联方法（例如光聚合，化学选择性连接，酶介导的交联）的高亲水性聚乙二醇（PEG）基聚合物来制备用于3D细胞培养的水凝胶。报道最多的例子是基于分支（多臂或星形）的前体，很少有涉及到末端官能化的线性链的交联，这些末端链可通过合成途径获得，但是通常需要其他组分来形成凝胶材料。硫醇基化学物质已在聚合物领域广泛用于橡胶的硫化，但一个缺点是它们的反应经常导致在储存过程中形成二硫键，这不利于以后的应用。因此，到目前为止，大多数使用环状二硫化物的方法都使用有利于亲核加成–消除的条件，导致需要额外的小分子试剂来稳定其材料，并证明其在生物材料中的应用具有挑战性。
【科研摘要】
水凝胶材料中的光化学连接策略对于模拟自然细胞外基质中发生的时空现象至关重要。近日， 荷兰莱顿大学化学研究院Roxanne E. Kieltyka教授团队描述了通过快速无副产物的紫外线辐射，使用环状1,2-二噻茂烷与线性聚（乙二醇）上的降冰片烯交联，导致从低粘度的前体溶液中产生分支的大分子结构和水凝胶材料。 振荡流变学和NMR数据表明一锅形成硫醚和二硫键交联。振荡流变学和共聚焦显微镜证明了水凝胶力学性能和功能的时空调控。NIH 3T3成纤维细胞在这些材料中是细胞兼容的，这为在生物医学领域进一步探索这种光敏交联部分提供了立足点。该研究以题为“Photopatternable, Branched Polymer Hydrogels Based on Linear Macromonomers for 3D Cell Culture Applications”的论文发表在6月《ACS Macro Letter》上。
【图文探讨】
1. 光构图水凝胶制备和机理
作者利用甲基天门冬氨酸在365-375 nm的紫外线下1,2-二硫杂环戊烷（DT）的不稳定性来制备水凝胶材料，该材料以时空方式控制其原子效率方式。 专门检测了它们在线性PEG聚合物上引入，以了解以简单且经济的方式制备用于3D细胞培养的光响应水凝胶材料的能力（图1）。使用碳二亚胺偶联化学通过一步反应法合成线性PEG聚合物（PEGdiDT，PEGdiNB），导致高度的末端官能化（约100％）。为了检查DT部分的UV介导的交联的可能性，使用DT的吸收在330 nm处最大，在365或375 nm（取决于光源）下进行UV照射。重要的是，单独或与线性PEGdiNB和光引发剂苯基2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂（LAP）一起照射线性大分子PEGdiDT），从低粘度的前体溶液开始产生水凝胶材料。
图1. DT和NB聚合物在细胞悬浮液的存在下发生光反应，形成水凝胶，其中的细胞被包裹在3D中。 在紫外线照射或双光子激光光刻过程中，可以使用光掩模用荧光标记的RGD肽进一步对它们进行构图。
2. 水凝胶流变学表征
用PEGdiNB代替一半的大分子单体（3.0 mM）并使用LAP（1.0 mM）导致胶凝时间大大减少（低于2分钟），并且储能模量大大增加（G'= 1265± 62 Pa；图2A）。没有LAP，紫外线照射30分钟后没有形成水凝胶（图2A）。同样，当尝试使用PEGdiSH和PEGdiNB作为对照进行交联时，没有水凝胶形成，除非使用了多臂交联剂（PEG4SH），数据指出了DT对于由线性大分子单体形成网络的重要性。此外，在保持等摩尔DT / NB比和恒定LAP浓度（1.0 mM）的同时增加总聚合物浓度（从4.0到16.0 mM）会导致高效水凝胶的形成，高原的G'从167±11 Pa升高到20018±1781 Pa（图2B）。因此，在光引发剂的存在下，光照射下，DT可以有效地与线性大分子单体上的NB形成水凝胶，其吸引人的速率可用于3D细胞培养。此外，水凝胶的G'可以间歇地使用紫外线辐射以逐步方式进行调节，从而证明了这种化学方法在需要空间或时间控制的应用中的潜力（图2C）。为了探究DT部分之间可逆的共价交联对DT-NB水凝胶性能的贡献，作者通过分步应变实验评估了它们自我修复的潜力。施加高应变后，所有水凝胶均显示出原始G'的50-70％回收率，并且回收率随DT浓度的增加而增加，这是由于网络中动态二硫键的数量增加（图2D）
图2.（A）在测量过程中，使用30分钟的UV辐照，在不使用LAP和使用LAP（1.0 mM）的情况下，PEGdiDT水凝胶和PEGdiDT – PEGdiNB水凝胶的平均时间扫描。（B）通过调节总聚合物浓度并保持[NB] / [DT]（1：1）的比例恒定（在200 ℃以下）来调节具有LAP（1.0 mM）的PEGdiDT–PEGdiNB水凝胶平台的储能模量（G '），5分钟紫外线照射）。（C）含有6.0 mM PEGdiDT–6.0 mM PEGdiNB –1.0 mM 的水凝胶的分步紫外线照射LAP。（D）在紫外线照射5分钟后，水凝胶（6.0 mM PEGdiDT –6.0 mM PEGdiNB –1.0 mM LAP）的平均阶跃应变测量。对于所有数据，紫外线照射条件：10 mW / cm 2，波长：320–500 nm，主峰：365 nm。数据的阴影部分指示何时施加光。
3. 水凝胶光构图3D培养细胞。
作者通过将NIH 3T3成纤维细胞封装在水凝胶材料中，检查了DT-NB反应在3D细胞培养中的应用潜力。最初的凝胶转化实验表明，PEGdiDT-PEGdiNB水凝胶在细胞培养基中形成，为涉及细胞的进一步实验打开了大门。当用紫外线照射2分钟的由2.0 mM PEGdiDT -2.0 mM PEGdiNB /1.0 mM LAP组成的水凝胶在24/48小时后的LIVE / DEAD分析中观察到大部分存活的细胞群（> 91％）。然而，培养48小时后，增加总聚合物浓度（6.0 mM）会使细胞活力降低至约80％（图4A，B）。通常，发现存在DT-NB交联反应的NIH 3T3细胞具有细胞兼容性。接着作者进一步研究了DT-NB反应在细胞培养应用中水凝胶材料的空间和时间光构图方面的潜力。合成了荧光素染料和DT标记的细胞粘附RGD肽（荧光素）GK（DT）GGGRGDS（图4C），以可视化和研究水凝胶和功能性肽之间紫外线激活的偶联的可能性，例如RGD。在最初的紫外线照射下形成水凝胶后，通过光掩模进行二次照射产生了RGD-水凝胶图案，在整个凝胶体积中均具有细胞大小的特征。此外，水凝胶的近红外吸收率低，可通过双光子激光光刻技术对肽-凝胶光耦合进行全面的空间控制（图4D）。使用这种技术，可以以细胞大小的相关长度尺度（1–100μm）将3D肽图样激光写入凝胶，从而突出显示了以用户定义的方式在空间和时间上引入RGD肽或其他生物活性提示的潜力。
图4.（A）在3D DT-NB水凝胶（3.0 mM PEGdiDT –3.0 mM PEGdiNB –1.0 mM LAP）3D中封装的NIH 3T3细胞在24和48小时后的代表性共聚焦显微镜图像，使用台式LED照射2分钟（～10毫瓦/厘米2，375纳米）。比例尺：100 μm。绿色：活细胞，红色：死细胞。（B）NIH 3T3细胞在24和48小时的平均细胞活力。误差棒代表独立样品的标准偏差。（C）荧光素标记的细胞粘附RGD肽的化学结构：( 荧光素）GK（DT）GGGRGDS。（D）通过DT-NB（3.0 mM PEGdiDT，双光子交联和结合的细胞粘附肽的共聚焦显微镜图像–3.0 mM PEGdiNB –1.0 mM LAP）通过直接激光写入。比例尺：200 μm。
【观点总结】
总而言之，作者证明了使用环状二硫化物DT作为潜在的硫醇，它在光引发剂的存在下参与与NB的高效且无副产物的光介导反应，从而形成细胞兼容的水凝胶材料。 DT部分在光激活时通过开环产生分叉的交联剂，该交联剂可以与其自身有效地交联，并且与NB一起形成可逆和不可逆交联。 重要的是，线性聚合物前体可用于通过DT和NB之间的反应制备水凝胶，并且可使用光在时空上控制其力学或功能。 因此，设想这些单元的组合可以为利用线性聚合物支架打开大门，该支架对于涉及细胞的多种生物医学应用是可合成获得的并且是经济的。
【通讯简介】
Roxanne Kieltyka加拿大人，本科毕业于University of Toronto（多伦多大学）化学系，获材料化学理学学士，2009年获加拿大McGill University（麦吉尔大学）化学系博士，师从Hanadi Sleiman教授。2009 – 2012年，她在荷兰Eindhoven University of Technology（埃因霍芬理工大学）从事博士后研究(合作导师：E.W. Meijer教授)。然后，2013加入荷兰Leiden University（莱顿大学）任教。她目前将研究重点放在超分子生物材料的设计，合成和使用上。 她的目标是在它们内部合成复制特定于细胞的微环境，以指导发育和疾病中的细胞行为。她发表了超过23篇SCI在国际期刊上。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsmacrolett.0c00175
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