Cancer cells enter dormancy afte

1. Background

​ 乳腺癌病人在初级治疗后数年常常会复发，而肿瘤得到缓解的这段时间， 被定义为肿瘤细胞的休眠。因此，肿瘤复发也可被定义为：残留的肿瘤耐药细胞在经过一定时间的休眠后增殖、恶化。那么肿瘤休眠的机制研究将对肿瘤治疗新方法的发现具有重要意义。由于肿瘤细胞的行为受到间质细胞的影响，因此本研究在3D共培养模型下研究间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）对乳腺癌细胞（breast cancer cells，BCCs）休眠行为的影响。

​ 主要发现如下：1. 3D hang drops培养状态下，MSCs可定向富集在BCCs周边；2. 3D共培养状态下，MSCs迫使BCCs聚集成球形；3. 球状聚集的BCCs将MSCs内在化（吃了）后进入休眠状态Σ(っ°Д°;)っ；3. 内在化MSCs帮助BCCs存活但抑制肿瘤发生（留得青山在，不怕没柴烧）；4. 转录组学及分泌组学的结果显示，休眠后的BCCs具有转录组及分泌组学上的变化。

2. Knowledge accumulation

1. Cell cannibalism: Cannibalism is the term used to describe “Cell-Eat-Cell” phenomenon.

3. Material and methods

1. Breast Cancer Xenograft Model: Female NOD/SCID mice (NOD. CB17-Prkdcscid/J)

2. Cell lines: Human cancer cell lines [MDA (triple-negative breast cancer), A549 (lung adenocarcinoma), PANC-1 (pancreatic carcinoma), and PC3 (prostate cancer)]

3. 3D Hang drop cultures: picture from “3D High-Content Analysis of Spheroids”

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4. Human MSC and DF Culture: 详见文章.

5. Microarrays. HTA_2.0 microarrays (Affymetrix) were performed on MDA monolayer control cells, MDA cells cultured for 72 h in hanging drops, and MDA cells sorted (CD90-negative) from 72-h MDA/MSC 3D cocultures.

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4. Results

1. 3D共培养下，MSCs促进三阴性乳腺癌细胞MDA细胞聚集成球状后MSCs快速消失

   ​ 将GFP标记的MSCs与MDA细胞共培养，使用荧光显微镜和流式细胞仪检测GFP荧光变化，实验分组如下：（1）3D MDA；（2）3D MSC-GFP；（3）3D MDA: MSC-GFP (1:1)。结果显示，MDA与MSCs共培养后，可使得MDA聚集成团，且GFP荧光含量随着共培养时间延长而减少，72 h时GFP含量减少至7％（0 h为49％），提示MSCs细胞数量的急剧下降。

   ​ 除此之外，通过流式细胞仪检测MSCs特异性标记物CD90的表达，CD90表达也随着共培养时间的延长而减少（72 h CD90表达减少至3％），证实了MSCs在与MDA共培养后快速消失的结果。

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2. 3D共培养情况下，MDA细胞会内在化MSCs（吃了）.

   ​ MSCs用CTG标记（绿色），MDA用CTR标记（红色），1：1共培养后，用荧光显微镜及流式细胞仪检测荧光变化，从结果中可见，随着共培养时间的延长，CTR与CTR双染色在24与48 h时达到68-69 ％，72 h后降低至24 h，而MSC-CTG不断减少。以上结果表明，MDA细胞将MSCs细胞内在化后，MSCs细胞消失。与此同时，通过流式细胞仪检测MSCs细胞特异性标记物CD90的表达后发现，CD90与CTG荧光变化趋势一致，进一步证实MDA细胞内在话MSCs的结果。其示意图如下：

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3. **内在化MSCs对BCC细胞增殖和成瘤性的影响 **

   in vitro 使用流式细胞仪、EdU proliferation kit、显微镜观察及MTS实验检测MSCs内在化对BCC增殖的影响，用流式细胞仪检测细胞周期变化。结果发现，3D共培养下，BCC内在化MSCs细胞后，BCC细胞增殖减缓，且该减缓与细胞周期无关。以上结果表明，MSCs内在化并未通过细胞周期下调BCC细胞增殖能力。

   in vivo 小鼠成瘤实验，将实验分为四组：（A）MDA单细胞单独接种；（B）MDA单细胞与MSCs单细胞共接种；（C）3D球状MDA；（D）MSCs共培养后分离出来的3D球状MDA。按照以上分组接种至 NOD/SCID小鼠体内。记录小鼠肿瘤形成时间、成瘤个数、肿瘤体积和量。结果显示MDA内在化MSCs后肿瘤生长能力显著低于单细胞样MDA，且D组小鼠尽有3只小鼠可成瘤。结果示意图如下：

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4. 内在化MSCs可使MDA细胞进入休眠状态（不老不死不生孩子）

   流式细胞分选技术分离共培养后的MDA细胞后，分别使用显微镜观察及MTS实验检测，不同营养条件下（1/10 ％ FBS）MDA细胞的增殖数量和增殖能力。同时使用流式细胞技术检测分选后MDA细胞周期变化及凋亡情况。结果表明，内在MSCs可降低MDA细胞增殖数量（不生孩子），可在不影响MDA细胞周期的情况下（不老），帮助MDA细胞抗凋亡度过营养缺乏的难关（不死）。

5. MSCs内在化对MDS细胞表型的影响

   Taken together, interactions between MDA cells and MSCs that result in cannibalization of the MSCs promote a unique cancer cell gene signature, highlighted by factors involved in inflammation, stress response, and dormancy.

5. Conclusion and discussion

conclusion: BCC可通过内在化MSCs进入休眠状态。内在化MSCs促使BCC聚集呈球状，且在不影响细胞周期的情况下，减少BCC细胞增殖并帮助BCC对抗营养压力及凋亡。

discussion：由于休眠状态下肿瘤细胞的抗压能力提升，且细胞表型发生变化，普通化疗药物可能对于休眠状态肿瘤细胞失效，从而诱发耐药，这也可能是抑制血管形成类抗肿瘤药耐药的原因之一（因其可在营养极度缺乏情况下存活）。