Extended Application of Genomic Selection to Screen Multi-Omics Data for the Development of Novel Pyroptosis-Immune Signatures and Predicting Immunotherapy of Glioma
基因组选择的扩展应用，为开发新的焦亡-免疫信号和预测胶质瘤的免疫疗法筛选多组学数据
发表期刊：Front Pharmacol
发表日期：2022 May 10
影响因子：5.988
DOI: 10.3389/fphar.2022.893160
一、背景
胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。这种疾病的肿瘤微环境（TME）的紊乱，主要在其晚期被诊断出来，可能导致广泛的肿瘤异质性。
焦亡是一种不同于细胞凋亡的裂解和程序性炎症细胞死亡的途径，涉及通过经典和非经典途径裂解气体蛋白，并能促进细胞的持续扩张，直到细胞膜破裂并导致细胞内容物的释放，从而引发强烈的炎症反应。通过释放炎症因子，焦亡可以激活自身免疫细胞。近年来，越来越多的报道说明了利用细胞焦亡通过不同的靶向和递送方法参与抗肿瘤免疫的可行性和治疗潜力。与此同时，越来越多的证据表明，胶质瘤微环境中细胞焦亡与免疫之间存在直接或间接的相互作用，尽管其潜在机制仍不清楚。
二、材料与方法
1.数据来源
1）来自TCGA698个胶质瘤样本的归一化基因表达谱（FPKM）和临床数据
2）来自CGGA1018个胶质瘤样本的RNA_seq和临床数据
3）来自GDCIllumina 450 k DNA甲基化阵列的总共598份资料
4）从cBioPortal收集突变率和拷贝数变异（CNV）频率
5）GSE121810
2.实验流程
流程图
三、实验结果
01 - 胶质瘤中焦亡调节因子的情况
作者回顾了一些文献，选择了11个基因作为焦亡调节因子，包括6个gasdermins和5个CASP基因，并发现所有焦亡调节因子的变异都很常见，而且大多集中在TCGA的拷贝数扩增上（图1A，B）。然后确定了9个焦亡调节因子在染色体上具有CNV的改变。这些结果表明，这九个调节因子的CNV状态与胶质瘤的进展和发生有关。对11个焦亡调节因子之间的互动模式的分析表明，Caspase 1（CASP1）是焦亡调节因子的关键节点，其次是Caspase 3（CASP3）、Caspase 5（CASP5）。它与Caspase 4（CASP4）、Gasdermin D（GSDMD）、Granzyme A（GZMA）和Granzyme B（GZMB）的关联在STRING数据库得到验证（图1C）。在660个样本中，11个焦亡调节因子的突变频率为1.97%（11个突变），其中大部分是错义突变。CASP1显示出最高的突变频率，其次是Gasdermin C（GSDMC），而CASP3、Gasdermin B（GSDMB）、Gasdermin E（GSDME）和GZAMB在胶质瘤样本中没有显示任何突变（图1D）。随后的研究表明，CASP5与CASP1、GSDMC和GSDMD之间存在相当大的共生突变关系。进一步进行了调节因子共同表达的相关性研究，发现CASP4和其他调节因子之间有相当大的相关性，其中CASP4和CASP1之间的相关系数最强（图1E）。此外，还调查了这些焦亡作用调节因子的表达模式与分子特征之间的相关性。在11个焦亡作用调节因子中，8个显示了胶质瘤和正常组织之间的显著差异，而CASP5、CASP8和GSDMC没有（图1F）。所有的调节因子都根据IDH1分子亚型被明确地分为不同的组（图1G）。
图1 焦亡调节因子景观
02 - 不同癌症类型中焦亡调节因子的遗传改变
根据以上结果确定了11个在胶质瘤中表达和突变水平明显不同的焦亡调节因子，并进一步探讨了其对泛癌的影响。总体突变负担较高的癌症类型（如UCEC、STAD和SKCM）也显示了较高的焦亡作用调节因子的突变频率。CASP1、CASP5、CASP8、GSDMC、GSDME和GSMA显示出较高的突变频率（图1H）。此外，对11个枢纽基因进行了GO富集，发现它们主要富集在 "细胞焦亡"、"细胞焦亡的执行阶段 "和 "对肿瘤坏死因子的反应"，这进一步证明了对细胞焦亡调节因子研究的正确性（补充图S2B）。进一步计算了所有焦亡调节因子的CNV改变频率，发现CNV改变是广泛存在的。GSDMB、GSDMC、GSDMD、GZMB和GSDME在不同的癌症类型中表现出广泛的CNV扩增（补充图S2C）。相反，CASP1、CASP3、CASP4、CASP5、CASP8、GZMB和GSDME保持了普遍的CNV缺失（补充图S2D）。
补充图S2 胶质瘤和泛癌中焦亡调节因子的突变特征
为了探究这些基因的改变是否会影响焦亡调节因子的表达，作者在另一个代表33种癌症类型近10000个样本中进行了焦亡调节因子的扰动表达，观察到CASP3、CASP4、CASP8和GSDMD在癌细胞中高度表达（图1I），CNV的改变可能是导致焦亡作用调节因子表达紊乱的主要机制之一。CNV扩增的焦亡调节因子在癌细胞中的表达明显更高（如GSDMD），而CNV缺失的调节因子的表达明显更低（如CASP1、CASP3和CASP4）。特别是发现GSDMD在33种癌症类型中表现出最高的表达。总之，这些发现表明，焦亡作用调节因子之间的串扰在大多数癌症类型（包括胶质瘤）的发展和进展中发挥了重要作用。
03 - 识别胶质瘤的焦亡模式
由于11个焦亡调节因子在肿瘤突变、CNV、相关性和内部表达谱上有明显差异，作者进一步探讨了焦亡模式。通过无监督聚类方法得到了两种不同的亚型，包括焦亡相关集群1（n=373）和焦亡相关集群2（n=325）（图2A，B），集群2的生存优势高于集群1（图2C）。进一步对胶质瘤中11个焦亡作用调节因子的表达谱进行了热图分析，发现除GSDMB和GSDMC外，其余9个基因在集群1中的表达水平都明显高于集群2。此外，发现所有焦亡调节因子的表达值在高级别胶质瘤患者（WHO III和IV）中都比较高，这意味着焦亡调节因子的表达值也可以反映肿瘤的等级（图2D-F）。对于IDH1突变状态，IDH1 wt主要集中在集群1，IDH1 mut主要集中在集群2。对于原始亚型，集群1包含所有8种亚型，集群2主要包含IDH mut-模型、IDH mut-非模型和IDH wt。从上述发现集群1是高表达的细胞焦亡调节因子组，而集群2 是低表达的细胞焦亡调节因子组。此外细胞焦亡分组与临床特征之间的密切相关性进一步说明了胶质瘤细胞焦亡模式的准确性和稳定性。
图2 胶质瘤中焦亡模式的鉴定
04 - 识别胶质瘤的免疫模式
作者分析了胶质瘤的免疫状态，这是由ssGSEA算法根据肿瘤组织中的免疫浸润确定的，胶质瘤患者通过分级聚类被分为两组（补充图S3A）。接下来，探讨了TME与免疫组之间的关联，计算了两组之间免疫浸润的区别，并观察到所有类型的浸润性免疫细胞在一组中明显富集，将其作为高免疫力组，另一组作为低免疫力组（补充图S3C）。高免疫力组的病人比低免疫力组的病人有更好的生存率（补充图S3B）。高免疫力组的免疫评分和基质评分的分布大大高于低免疫力组，而肿瘤纯度的结果则相反（补充图S3F）。ICP对于癌症免疫治疗至关重要，许多ICP激活剂和拮抗剂正在临床肿瘤学中进行评估，作者进一步分析了它们在不同亚型中的表达水平，40个ICPs基因在TCGA队列中可以检测到（补充图S3E）。接下来，计算了HLA基因集和两种免疫类型之间的关联。如结果所示，低免疫力组的样本比高免疫力组的样本有明显的高表达（补充图S3D）。观察到的ICPs调节的区别可能对联合免疫疗法有影响，而在诱发ICPs方面发挥作用的各种机制进一步强调了其生物学意义。
补充图S3 通过分层聚类分析698个胶质瘤样本的免疫景观
05 - 识别胶质瘤的焦亡症免疫亚群
基于上述焦亡和免疫状态，进一步将其合并为一个二维指标，将患者分为四组。"LILP(low-immunity and low-pyroptosis)"、"LIHP(low-immunity and high-pyroptosis )"、"HIHP(high-immunity and high-pyroptosis) "和 "HILP(high-immunity and low-pyroptosis) "组（图3A）。生存分析表明四组之间有相当大的区别，"HILP "组的病人生存率最好，而 "HIHP "组的病人预后最差（图3B）。相关文献表明，免疫状态也可能与突变接触，并且更高的TMB和体细胞突变率与更大的抗癌免疫力相关。作者使用突变数据集计算了每个病人的突变和TMB，并在所有的不同焦亡免疫模式中分析了它们的差异。在四种焦亡免疫亚型中，LILP和HILP的突变率最高，其次是LIHP，以及HIHP。IDH1 mut率在LILP和HILP中最高，其次是LIHP和HIHP（图3C-F）。IDH1 mut在很大程度上影响了胶质瘤患者的结局。因此，IDH1 mut在焦亡免疫亚型中的区别可能是影响患者生存的一个因素。
图3 鉴定焦亡免疫组群
通过应用彗星算法对前25个突变基因的共同发生景观进行了调查。与普遍存在的互斥景观相比，10对基因（IDH1-PTEN、IDH1-EGFR、TP53-CIC、CIC-ATRX、FUBP1-CIC、FUBP1-TP53、IDH1-IDH2、PIK3CA-TP53、ZBTB20-TP53和IDH1-PTEN）显示了互斥突变，表明它们在共同的途径中可能有冗余效应，并且在它们之间保留一个突变的拷贝有选择的优势（补充图S4A，B）。补充图S4C-F中说明了相应队列中前10个差异最大的基因。有趣的是，IDH1在四个队列中占据了首位，它调节了胶质瘤中不同的肿瘤相关的生物过程。
补充图S4 四个亚组突变的差异基因
在HIHP和LIHP中，TMB明显高于LILP和HILP（补充图S5A）。在检查了上述四个焦亡免疫亚群的转录改变后，进一步研究了这四个亚群之间是否存在基因组水平的差异。HIHP和LIHP中的SNPs和Total也高于HILP和LIHP，而在四种焦亡免疫亚型中，大多数基因组变异是错义突变（补充图S5B，C）。从上述结果中发现四种焦亡免疫亚型具有明显的生存和突变差异，这为进一步探索焦亡免疫特征提供了基础。
补充图S5 焦亡免疫相关群体TMB突变类型之间的关系
06 - 鉴定焦亡免疫特征
由于四个焦亡免疫亚组之间存在明显的生存差异，作者对生存差异最大的亚组进行了差异基因分析。计算了亚组HILP和HIHP、HILP和LIHP、LHLP和HIHP、LILP和LIHP之间的DEGs。使用Venn Diagram网络工具，在基于LILP和HIHP组的DEGs、HIHP和HILP组的DEGs、LILP和LIHP组的DEGs、HILP和LIHP组的DEGs中得到55个DEGs（图4A）。
无法维持正常的DNA甲基化，包括CpG岛的高甲基化和CpG贫乏区的低甲基化，增强了诱发肿瘤形成和进展的敏感性，因此研究和对比了DNA甲基化模式在焦亡免疫亚群中的影响。应用维恩图，在基于LILP和HIHP组的DMP、HIHP和HILP组的DMP、LILP和LIHP组的DMP、HILP和LIHP组的DMP中得到24个DMP（图4B）。进一步研究了24个DMPs在四个焦亡免疫亚群中的分布以及与临床特征之间的关系。结果显示，24个DMPs在HIHP和LIHP组的表达明显低于HILP和LILP，与免疫评分和基质评分较高的结果相反（图4C）。此外，发现在24个DMPs的低表达组中，G4级肿瘤和IDHwt的患者居多，而24个DMPs的低表达往往对应着高表达的基因，因此其对应的基因也可能是影响胶质瘤预后的焦亡免疫基因（图4F）。同时，24个DMPs对应10个基因，将55个DEGs和10个基因，以及1个突变DEG结合起来，得到了总共66个焦亡免疫特征。为了进一步获得更准确的焦亡免疫预后特征，对66个特征进行了单变量和多变量的cox回归，得到了9个焦亡免疫特征：CADM3、CNST、GDF10、KCNC2、LINC00641、NAP1L2、NAPB、NCOA7和SERINC1。
图4 识别焦亡免疫特征
07 - 构建焦亡免疫预后模型和验证焦亡免疫预后模型风险分数
为了验证这九个焦亡免疫特征对胶质瘤患者生存的重要性，作者通过lasso回归法构建了九个焦亡免疫特征的PIPM（图4D，G）。然后进行焦亡调节因子和焦亡免疫特征之间的相关性研究，发现焦亡免疫特征与焦亡调节因子有明显的负相关关系。此外构建了基于PIPM的评分系统，根据中位数PIPM风险评分，将样本分为高风险和低风险队列。K-M曲线显示，与低风险队列相比，高风险队列的OS较差（补充图S8A）。无论采用何种治疗方法，低风险组的生存优势都优于高风险组（补充图S8C，D）。在风险曲线中验证了PIPM风险评分和OS的分布，结果显示9个特征的表达与PIPM风险评分和OS呈显著负相关（补充图S8B）。时间ROC显示对TCGA队列的1、3、5、7、10年预后预测的平均AUC值达到0.86、0.91、0.89、0.85和0.8（补充图S8E）。存活率ROC显示PIPM风险分数对1年、3年和5年预后预测的平均AUC值达到0.852、0.900和0.869，并明显高于其他临床特征（补充图S8F-H）。这些结果说明了PIPM在预测胶质瘤患者的预后方面的准确性。
补充图S8 基于PIPM预测TCGA队列中病人的预后
然后，根据胶质瘤样本的风险分值进行排序，并测试是否有人口统计/分子/临床特征与PIPM有关（补充图S9A）。结果显示，PIPM风险分值随着等级的提高而逐渐增加，IDH1 mut患者的PIPM风险分值低于IDH1 wt患者，1p19q non-codel患者的PIPM风险分值明显高于1p19q codel患者（补充图S9B-D）。两个亚组内不同肿瘤等级的分布显示，G4只出现在高危组（补充图S9E）。IDH1 mut在两个亚组中的分布显示，IDH1 mut在低危组中占大多数（补充图S9G），1p19q codel的分布在低风险组明显高于高风险组（补充图S9F）。这些发现验证了PIPM预测临床和分子特征的准确性。
补充图S9 等级、IDH1突变类型、1p19q状态和风险分数之间的关系
为了进一步证实PIPM预测患者预后的准确性，作者还在CGGA队列中验证了PIPM，K-M生存分析显示与TCGA队列的结果相同（补充图S10A）。无论何种治疗方法，低风险组的生存优势都高于高风险组（补充图S10E，F）。时间ROC显示，CGGA队列的1、3、5、7和10年预后预测的平均AUC值达到0.71、0.76、0.77、0.77和0.82（补充图S10H）。在CGGA队列中确定了PIPM风险评分与IDH1mut类型、复发状态和1p19q编码的关系的定量分析，这些发现与TCGA队列中的发现一致（补充图S10B-D）。两个亚组内复发状态的分布显示，复发和继发状态占高危组的大部分（补充图S10I）。IDH1mut在两个亚组内的分布显示，IDH1突变占低危组的大多数（补充图S10K）。1p19q codel的比例在低风险组明显高于高风险组（补充图S10G）。这些发现进一步证明了PIPM在预测患者预后和分子分型预测方面的准确性。
补充图S10 在CGGA队列中验证PIPM的有效性
08 - 确定潜在的化合物/抑制剂靶向焦亡免疫预后模型
作者对高风险组和低风险组进行了差异化分析，进行GO、KEGG和GSEA来预测高风险组和低风险组之间的DEGs的潜在表现。发现 DEGs在焦亡和免疫途径中富集，如中性粒细胞脱颗粒、中性粒细胞激活参与免疫反应、神经变性-多种疾病的途径、标志细胞凋亡、标志DNArepair和标志补体（补充图S11A-C）。应用连接图（CMap）以寻找可能针对与化合物相关的路径的候选者，这些路径与焦亡免疫有关。发现了11种与焦亡免疫有关的化合物的富集程度（补充图S11D）。对这8种化合物的CMap作用模式（MoA）分析表明，上述化合物共有8种作用机制（补充图S11E）。观察到阿普唑仑作为肾上腺素受体拮抗剂共享MoA，益康唑作为细菌细胞壁合成抑制剂、羊毛甾醇脱甲基酶抑制剂和甾醇脱甲基酶抑制剂共享MoA。
补充图S11 TGCA队列中高风险组和低风险组之间的DEGs功能富集分析
作者发现，与低风险组相比，高风险组表现出较高的TMB、TIS、较低的TIDE、MSI Expr Sig、功能障碍、排异和较差的预后，这一结果显示高风险组对ICB治疗的反应可能比低风险组更好，上述三个指标的分布进一步确定了PIPM在预测患者免疫治疗疗效方面的优势。随后调查了TMB和TIS与风险索克雷的相关性，结果显示它们之间的相关性很高，分别为0.49和0.58。PIPM各组之间出现干系差异；具体来说，高风险组的去分化表型明显，而低风险组的分化表型明显。此外，mDNAsi、DMPsi、EREG-mDNAsi、ENHsi和EREG-mRNAsi与PIPM风险评分积极显著相关。总之，两组PIPM的肿瘤分化程度、TMB、TIDE和TIS有明显区别。使用三种不同的标记（TMB、TIDE和TIS）对PIPM进行了综合分析，评价了ICB治疗的反应，这进一步支持了PIPM的准确性和稳健性。
09 - 焦亡免疫预后模型风险评分在免疫治疗中的作用
为了评估PIPM的免疫状态，使用ssGSEA进行胶质瘤样本的免疫浸润。在TCGA和CGGA队列中，不同亚组的免疫细胞成分显示出相似的免疫细胞得分（补充图S14A，S15A）。此外，计算了两组之间的免疫细胞浸润的区别，发现28种免疫细胞在高危组中相当丰富（补充图S15B）。此外，还发现在TCGA队列中可以检测到40种ICPs，在TCGA队列的高风险组中被上调（补充图S15D）。然后，计算了PIPM风险分数和ICPs之间的皮尔逊相关系数，除ADORA2A和CD200外，PIPM风险分数与所列38个ICPs之间存在正相关。此外，TCGA和CGGA队列中上调的ICPs也集中在高风险组。在TCGA队列中检测到23个ICD基因，其中22个在两个亚组中明显不同，在TCGA队列的高危组中大大增加（补充图S14E）。CGGA队列中上调的ICD也与TCGA队列的结果相同（补充图S15C）。
补充图S15 CCGA队列中PIPM的免疫状况
为了验证PIPM的免疫可靠性，接下来进行了两个亚组和之前报道的六种泛肿瘤免疫亚型（C1-C6）之间的联系，高风险组中C4和C6的比例大大高于低风险组。如补充图S14C所示，高危组中C4和C6样本的高比例与六个群组中最差的预后相一致。同时观察了两个亚组中IDH1mut状态的比例，结果显示IDH1mut在低风险组中占主导地位，这与低风险组的预后较好相一致（补充图S14D）。两个队列（TCGA和CGGA）的免疫细胞含量的相对相似性加强了PIPM的稳健性。
补充图S14 TCGA队列中PIPM的情况
PIPM中不同的胶质瘤亚组应指导临床治疗。作者比较了高危组和低危组对30种常见抗癌药物的敏感性，以选择潜在的胶质瘤治疗方式。共有24种化疗药物的IC50估计值在高危组和低危组之间有明显不同（图5A-D）。低风险亚组的患者可能对这些药物敏感。在这种情况下，这些药物可以在未来应用于胶质瘤的治疗。
图5 估计PIPM高风险和低风险患者的药物敏感性
免疫检查点阻断策略，如PD-1和PD-L1，是有希望的治疗方法，考虑到一些患者对免疫治疗有耐受性，需要确定对免疫治疗敏感的生物标志物。在这项研究中，利用了PIPM风险评分来评估对免疫疗法的反应，作者对GSE121810队列中焦亡免疫调节因子的表达模式进行了配对比较分析。为了彻底分析PIPM风险评分和免疫疗法之间的关系，对接受pembrolizumab（一种针对PD-1的单克隆抗体）的患者进行了进一步分析。观察到有反应（CR和PR）组的PIPM风险评分大大低于有疾病（PD，补充图S16H）组。高PIPM风险评分组的PD比例明显高于低PIPM风险评分组（补充图S16E）。通过生存分析发现，低PIPM风险评分组有明显的生存优势，说明PIPM风险评分可以代表对免疫治疗的敏感性（补充图S16F）。最后，分别对PIPM风险评分与TMB和Neotigen进行了相关性分析，结果显示它们之间存在高度的相关性（补充图S16G）。
Atezolizumab是一种靶向PD-L1的单克隆抗体，已被FDA认可用于肿瘤治疗。作者计算了接受atezolizumab的患者样本的PIPM风险评分，发现低PIPM风险评分组有明显的生存获益（补充图S16A）。对免疫疗法有明显反应的患者的PIPM风险得分的分布显示CR/PR组的PIPM风险得分大大低于SD/PD组，说明PIPM风险得分可以代表患者对免疫疗法的敏感性（补充图S16B）。此外，两个亚组内不同肿瘤分期和等级的比例显示，III和IV级主要存在于高危组（补充图S16C）。最后，观察到高PIPM风险得分组中SD/PD的比例大大高于低PIPM风险得分组（补充图S16D）。
补充图S16 PIPM在PD1/PD-L1免疫疗法中的作用
鉴于前面描述的PIPM风险评分和免疫治疗反应之间的稳健关系，作者进一步探究了PIPM评分系统在不同癌症类型中的功效，并发现在每种癌症类型中，焦亡免疫调节因子的表达水平与PIPM风险评分之间存在相当大的相关性。这些调节因子，即UVM、UCS、THCA、PRAD、PAAD、LIHC和BRAC的表达值与PIPM风险评分呈正相关，而其他则呈负相关（图6A）。此外，发现CNST、GDF10、KCNC2、NAP1L2、NCOA7和LINC00641在癌细胞中也显示出较高的表达（补充图S17C）。如补充图S17A,B所示，观察到PIPM风险评分也是大多数癌症的一个重要预后（就PFI或OS而言）风险因素。PIPM风险评分与所有肿瘤类型（包括胶质瘤）的不良预后之间的关联，可能表明了癌细胞的起源或焦亡免疫调节剂的影响。然后，观察到除了CESC、CHOL、COAD、KICH、KIRC、MESO、READ、UCEC和UCS之外，estimate分数与PIPM风险分数之间也有明显的关联（图6B）。作者计算了22种免疫细胞的比例与PIPM风险评分之间的关联，发现除CHOL外，32种癌症类型的关联趋势不同。调节性T细胞CD4记忆型、T细胞CD4幼稚型和巨噬细胞M1的比例与大多数癌症类型的PIPM风险得分有关（图6C）。最后，发现除CHOL、LUAD、SKCM和UVM外，32种癌症的PIPM风险评分与干细胞指数之间存在关联（图6D）。作者全面评估了PIPM评分系统与泛癌症领域的相关性，深入探讨了PIPM风险评分在泛癌症中的优良特性，为PIPM在肿瘤学中的广泛应用奠定了基础。
图6 PIPM风险评分在不同肿瘤类型中的表现
补充图S17 不同肿瘤类型的PIPM风险分数的存活率
四、结论
本研究通过焦亡调节因子构建了4个焦亡免疫亚群，通过分析4个焦亡免疫亚群之间的差异表达基因，获得了9个焦亡免疫特征。通过多组学数据分析，为评估胶质瘤的复杂异质性提供了9种新的焦亡免疫特征。通过焦亡免疫特征构建细胞焦亡免疫预后模型（PIPM），建立胶质瘤队列的PIPM风险评分，然后对肿瘤微环境的分析揭示了PIPM风险评分与干性、免疫检查点表达、渗透免疫系统和胶质瘤治疗反应的意外相关性。泛癌分析结果显示，PIPM风险评分与临床结局、免疫浸润和肿瘤干性之间存在显著相关性。PIPM有可能显示出令人信服的临床价值，有可能导致胶质瘤患者的OS改善，甚至发展出新的治疗策略。
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