Subread

Subread是一种通用的reads aligner，可用于映射基因组DNA测序和RNA测序技术生成的reads。出于基因表达分析的目的，推荐使用Subread

在映射RNA-seq读数时，Subread仅应用于基因表达分析。对于需要读数完全比对的其他目的（例如检测基因组变异），应使用Subjunc aligner。
Subjunc：检测外显子 - 外显子连接并绘制RNA-seq读数。Subjunc是RNA-seq reads 比对工具，专门用于检测外显子 - 外显子连接并执行reads的完全比对（特别是外显子跨读）。

首先，下载安装subread

下载地址是：http://subread.sourceforge.net
找到对应的linux版本即可，因为我已经装了conda，所以直接用conda下载，下载好了之后可以直接调用，方便很多

conda install -y subread

使用

reads比对到参考基因组

第一步：构建索引
subread要求参考基因组的fasta必须要构建索引

subread-buildindex -o hg38 hg38.fa 

第二步：比对
比对示例代码可以用以下：

subread-align -t 1 -T 5 -i hg38  -r reads1.txt -R reads2.txt -o output.bam

其中，各个参数的意思是
-T：5个线程
-t：指定数据类型，0代表RNA-seq，1代表DNA-seq
-i：指定参考基因组的basename
-r和-R：指定输入的fq1和fq2文件
-o：指定输出文件
还有其他的参数，如：
-I：指定最高可以检测到的indel长度

featureCounts

featureCounts是一种非常高效的工具，可对基因组特征（如基因，外显子，启动子，基因体，基因组区和染色体位置）的映射读数进行计数。它可用于计数RNA-seq和基因组DNA-seq读数。

常见的命令有：

# 使用5个线程汇总单端读取数据集：
featureCounts -T 5 -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_SE.sam
# 总结BAM格式数据集：
featureCounts -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_SE.bam
# 同时汇总多个数据集：
featureCounts -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt library1.bam library2.bam library3.bam
# 执行特定于链的读取计数（如果反向搁浅则使用'-s 2'）：
featureCounts -s 1 -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_SE.bam
# 总结配对末端读取和计数片段（而不是读取）：
featureCounts -p -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_PE.bam
# 汇总多个配对端数据集：
featureCounts -p -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt library1.bam library2.bam library3.bam
# 计算片段长度仅在50bp和600bp之间的片段：
featureCounts -p -P -d 50 -D 600 -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_PE.bam
# 计算仅具有两端映射的片段：
featureCounts -p -B -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_PE.bam
# 从片段计数中排除嵌合片段：
featureCounts -p -C -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_PE.bam

一些参数的意思：
-a 注释文件，也就是GTF或者GFF文件，通过这个文件才能区分出哪些区域为外显子；
-o 输出结果文件，同样会输出一个以该名字结尾的.summary统计文件；
-F 指定输入注释文件类型，包括GTF，GFF，SAF等；
-t 指定注释文件中功能类型，默认外显子exon
-g 指定注释文件中属性信息，默认为gene_id
-A 如果基因组与注释文件中染色体ID不同，可以通过-A指定一个别名文件，例如有些基因组直接用数字表示染色体号，有些使用chr前缀；
-f 计算级别，以基因还是外显子为单位进行计算；
-M 如何处理多重比对reads
-Q 比对质量值阈值，小于此值的reads不用于计算；
-G 参考序列文件