MicroRNA 26a (miR-26a)/KLF4 and

MicroRNA 26a (miR-26a)/KLF4 and CREB-C/ EBPβ regulate innate immune signaling, the polarization of macrophages and the trafficking of Mycobacterium tuberculosis to lysosomes during infection

摘要：为了有效清除结核分枝杆菌，巨噬细胞倾向于分化为M1，导致与产生抗菌效应分子如一氧化氮(NO)和促炎细胞因子(如白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(α)相关的转录因子的激活。同时，炎症消退与M2极化、精氨酸酶和IL-10等细胞因子的产生增加有关。调控M1和M2极化之间平衡的转录和转录后机制，以及包含细菌的过程，如自噬和Mtb向溶酶体的运输，还未得到充分的理解。在这篇文章里，作者首次报道了miR-26a的靶基因是KLF4，这是一个转录因子。在Mtb感染过程中，miR-26a(体内外均可观察到)的下调促进了KLF4的表达，而KLF4又促进了精氨酸酶的升高和iNOS活性的降低。我们进一步证明KLF4能防止Mtb被转运到溶酶体。CREB-C/EBPβ信号轴也有利于M2极化。在感染巨噬细胞和感染小鼠体内均可观察到miR-26a的下调和C/ebpbeta的上调。C/ebp beta的敲除抑制了感染的巨噬细胞中M2标记Il10和IRF4的表达。这些途径的重要性被观察到miR-26a模拟或敲除Klf4或Creb或C/ebpbeta的表达，减弱了巨噬细胞中MTB的存活而得到证实。综上所述，我们的结果认为miR-26a/klf4和crEB-C/eBPβ信号通路在调控巨噬细胞中MTB的存活中起着关键的作用。这些研究扩展了我们对mtb劫持宿主信号的理解。

从转录组数据中发现了KLF4和C/EBPβ分别上调和下调，这两个是转录因子。

FIG1AB-使用RT-qPCR验证了KLF4和C/ebpβ这两个转录因子的表达。

FIG1C-在蛋白水平上，KLF4表达上升。

一些转录后机制可能与KLF4 mRNA和蛋白质水平关系有关。

作者研究了miRNA的表达情况，发现了miR-26a表达量下降（因为它的靶基因是KLF4）。

FIG1D-miR-26a与KLF4的结合位点。

FIG1EFG-双荧光素与WB实验。

FIG2ABC-感染Mtb过程中，miR-26a下调。

FIG2DE-感染Mtb过程中，pri-miR-26a下调。

FIG2FGHI-过表达miR-26a，Mtb存活下降，抑制miR26a,Mtb存活上升。

FIG2JKL-Mtb感染过程中，肝，肺，淋巴结的miR-26a也下降。

FIG3ABCD-感染过程中，KLF4表达上升，加入了miR-26a mimics后，KLF4表达下降。

FIG3E-感染过程中，加入miR-26a inhibitor后，KLF4表达量上升。

FIG3F-MG132是蛋白酶体抑制剂，这一步实验是为了说明，miR-26a并非是参过发挥蛋白酶体的作用来使KLF4下降的。

M1巨噬细胞能产生ROS与RNS用于清除胞内菌。M2巨噬细胞则产生一些抗炎细胞因子，IL-10，Arg1（它能与精氨酸竞争地与iNOS结合）。有报道指出，KLF4会促进巨噬细胞向M2极化，作者研究了一下KLF4在调控iNOS和精氨酸方面的作用。

FIG4ABCDEF-敲低KLF4能降低Mtb诱导的精氨酸酶(arginase）的活性。同时升高Mtb诱导的nitrite的产生，以及诱导iNOS的表达。

FIG4GHIJ-感染Mtb前，转染miR-26a mimic，能抑制精氨酸酶的活性，同时升高nitrite的产生。

FIG4KL-miR-26a inhibitor能抑制Mtb诱导的nitrite的产生，提高精氨酸酶的活性。

FIG5AB-敲低KLF4能增强Mtb的存活。

FIG5C-加入L-NAME（iNOS抑制剂），敲低KLF4后，Mtb复制增强，这说明，KLF4促进Mtb存活的部分机制是通过调控iNOS和NO来实现的。

FIG6ABCD，IJ-共聚焦图片显示，转染了miR-26a后，自噬增强。

FIG6EFGH-加入了miR-26a抑制剂后，能抑制LC3的形成，这些数据说明，Mtb的感染能下调miR-26a，抑制自噬。

FIG7ABCD-敲低KLF4后，自噬增强（LC3形成）。

FIG7E-Mcl-1是KLF4这个转录因子的一个靶基因。敲低KLF4能降低Mcl-1在Mtb感染过程中的表达。

FIG7F-转染miR-26a能降低Mcl-1的表达。

FIG7G-转染miR-26a，KLF4的表达质粒，Mcl-1的水平能恢复。

上述数据说明，miR-26a能降低KLF4调节Mcl-1的水平。总之，miR-26a/KLF4能调控自噬。

FIG7H-3MA是一种自噬抑制剂，KLF4敲低后能促进Mtb的存活，而3MA则能消除这种现象，这说明，KLF4是通过自噬来促进Mtb存活的。

FIG8AB-转染了miR-26a后，Mtb与lysosomes的共定位增多，说明miR-26a能促进Mtb与lysosome的融合。

FIG8CD-当KLF4敲低后，有同样的上述效果出现。

这说明，抑制miR-26a，上调KLF4是Mtb抑制Mtb向lysosome融合，以实现自身存活的一个机制。

C/EBPβ参与巨噬细胞M1/M2的极化。在FIG1B中已经发现了在Mtb感染过程中，C/EBPβ表达升高。

FIG9A-敲低Creb后，能降低Mtb感染过程中C/EBPβ的表达。

FIG9BCDE-敲低Creb后，能增强nitrite的表达，降低arginase的表达。

FIG9F-敲低STAT6后，能降低Mtb诱导的arginase的表达。

上述结果说明了C/EBPβ能与STAT6协同激活Mtb感染过程中arginase的表达。

FIG9GHI-敲低KLF4或C/ebpβ能抑制arginase酶的活性。

FIG10ABCD-有文献报道，C/EBPβ促进M2，抑制M1.在Mtb感染过程中，M2巨噬细胞的Msr1，Arg1，Socs3，Irf4，Ccl24和Il10表达量上升。

FIG1-GHI-敲低C/ebpβ能抑制上述基因的表达。同时，M1的标记，IL12p40，TNF-alpha与IL-6的表达上升。

上述这些结果说明了在Mtb感染过得中，C/EBPβ的长，能促进巨噬细胞向M2极化。

CREB-C/EBPβ信号转导与arginase活性的增强有关，它能降低NO的产生，促进巨噬细胞向M2分化，这有可能有利于Mtb的存活。敲低Creb或C/ebpta能降低Mtb在巨噬细胞中的存活。