这个是重点中的重点，虽然是最基础的，但是这个的结果将直接影响下游的多种分析，可以说是核心文件。

怎样去选择参数，这个貌似要看自己的观点，其实就是告诉软件怎样打分，或者更确切的说，mismatch扣几分，deltion扣几分，开个gap扣几分

然后软件根据你制定的规则来找出得分最高的align的位置

几乎所有的alinger的默认选择都是EDNAFULL标准

这个标准可以这样下载

curl -O  ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/matrices/NUC.4.4

#打分矩阵
    A   T   G   C  
A   5  -4  -4  -4  
T  -4   5  -4  -4  
G  -4  -4   5  -4  
C  -4  -4  -4   5  

关于怎样选择合适的矩阵，有这个WIlliam Pearson 牛逼哄哄的论文可以参考

这里还有各种矩阵可供选择

不过得小心一点，有一些标准化过了，有一些没有标准化，虽然名字可能看起来都差不多

Gap penalty

这个也是比较重要的参数，penalty的标准有很多，一般来说软件都用Affine的gap penalty，这个考虑两个参数。第一个就是gap的open，也就是发现一个gap。第二个是gap的extension，也就是这个gap的长度。如果你觉得，出现gap比较讨厌，就可以将open的罚分设的高一点。如果觉得出现比较长的gap很讨厌，就把extension的罚分搞高一点就好。但是一般来说，open的罚分会比较高，extension的罚分相对来说小很多。

全局对比

目的是看两条序列的相似程度
这里两条序列中每一个碱基都得对齐到另一条序列的相同碱基，或者是错配碱基上，或者是gap上。划重点，每一条每一个碱基

工具是EMboss套装，工具的开发者本意是帮助生信不熟的生物僧来使用，所以用起来会有很多的提示信息，可能会比较烦人，所以加个参数‘-filter’， 世界顿时就清净了许多。

里面的全局对比的命令使用gapopen罚分是10分一个，软件觉得开一个gap就丢很多分，所以就倾向于少开gap，宁可准确对齐的碱基少一点，也比开个gap罚分小
但是当我们用 -gapopen 7 将罚分降低一点，软件顿时就舒服了很多，开gap也不那么谨慎了，所以对齐的碱基可能更多一些，但是相应的gap也多了很多。

还可以用‘-data’ 指定打分的矩阵文件

一般来说软件可能会采用 free-end-gap，就是说最末尾有gap罚分不那么高，

局部对比

主要是用来寻找两条序列中相似度最大的小区域，划重点，其中的一小段区域
算法主要是寻找两条序列中各自的一小段序列，这两小段序列相似度特别高

打分矩阵不同，结果很不一样

# DNA矩阵
# This matrix is the "standard" EDNAFULL substitution matrix.
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/matrices/NUC.4.4

#蛋白矩阵
# Get the BLOSUM30, BLOSUM62, and BLOSUM90 matrices.
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/matrices/BLOSUM30
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/matrices/BLOSUM62
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/matrices/BLOSUM90

半全局对比

这个是我们测序分析的时候最常用的算法，主要用来将一小段短序列对比到很长的序列中，也就是将测序的reads对比到参考基因组中

准确配对，配对误差，软件的局限性

看了这么多，其实最关心的就是，到底准不准，到底结果能不能还原出真实的生物学事件。

作者做了个小实验，在原始序列里面的长串的C两边各插入一个C，结果全局对比到原始序列时，第一位置错误，第二将两个C的insertion报告为一个CT插入后紧跟一个T错配。

原因就是这一串串的C里面给出的信息太少，aligner从中获得不到任何的纠错区分能力，aligner只能寻求数学上的最优解，而不能找出更加符合生物学解释的方案。

这是不是说数学上的最优解不一定是生物学的最优解，所以生物僧做好实验还是意义重大的。

以上的问题可以用一个参数很轻易的解决，就是gapopen=9，也就是一个gap不要罚十分，罚九分就好。

但这个绝对不是说以后就要用gapopen=9 而不是10这个默认参数，调整参数的影响是很深远的，直接会影响到本来会正确的align的reads。使用9这个参数的结果就是，两个正确的碱基配对得分5+5=10分，而一个gap只罚分9分，小于10，所以align在遍历基因组的过程中，只要找到一个gap跟着两个碱基的match就会得分正值，判定为正确配对。在某些特定的情况下，可能挺好，但是绝大多数情况不太行。

以上的错误，并不是由于参数设置错误所导致的，问题的本质在于连续多个C导致的均聚区域给出配对信息太少，软件无法根据这么少的信息纠正错误。

配对可靠性取决于序列本身自己的复杂程度以及能够给出的信息量

复杂度比较低的区域通常给出的align的结果不是很可靠，需要额外的验证

多条序列align

mafft --clustalout small.fa > alignment.maf

KR105345.1      -------ataattttcctctcattgaaatttatatcggaatttaaattgaaattgttact
KR105328.1      --gattaataattttcctctcattgaaatttatatcggaatttaaattgaaattgttact
KR105323.1      --gattaataattttcctctcattgaaatttatatcggaatttaaattgaaattgttact
KR105302.1      --gattaataattttcctctcattgaaatttatatcggaatttaaattgaaattgttact
KR105295.1      ---attaataattttcctctcattgaaatttatatcggaatttaaattgaaattgttact
KR105294.1      --gattaataattttcctctcattgaaatttatatcggaatttaaattgaaattgttact
KR105282.1      --gattaataattttcctctcattgaaatttatatcggaatttaaattgaaattgttact
KR105266.1      ---attaataattttcctctcattgaaatttatatcggaatttaaattgaaattgttact
KR105263.1      aagattaataattttcctctcattgaaatttatatcggaatttaaattgaaattgttact
KR105253.1      ---attattaatyttcctctcattgaaatttatatcggaatttaaattgaaattgttact
                        **** ***********************************************

还可以用clustal-omega 来多序列对比