我最近分化的细胞发现经常会出现团快，不管的话会越来越多，检测发现细胞状态很差，大多是死细胞，只能丢弃。因为分化时间很长，很心痛，网上查了一下原因。
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这是我的细胞，一直是悬浮培养，不进行胰酶消化，平时离心用1800rpm，所以可能是加速度过大，或者我混匀时过于粗暴。并且细胞扩增很快，我也没注意细胞密度，。之前隔一天换一次液，操作较密集致使细胞老化，死亡。
- 为什么细胞喜欢“抱团”
首先要明确一点，常规的“抱团”是指贴壁细胞被消化后悬浮状态下的聚集情况。细胞在贴壁生长时，聚集在一起是正常现象。当周围细胞寥寥无几，而这一团已经叠层生长，这就是在悬浮状态就已经聚团的细胞再贴壁导致的。相同条件下，培养的癌细胞对密度依赖性的生长抑制敏感性降低，所以即使在形成单层后，也不会停止生长，而是相互堆积形成多层生长的聚集体。
其次，部分细胞被污染后会出现细胞聚团，这和操作有很大关系，比如：传代铺板时，是否进行了活细胞计数并及时调整浓度；终止消化时间点是否准确；混匀是否过于轻柔或粗暴；胰酶是否浓度过高；离心收集时，加速度是否过大等，都会直接影响子代细胞状态。
另外，过度消化细胞、状态不好的老化细胞也可能会出现聚团。很多人觉得细胞多多益善，经常将贴壁细胞养到叠层、或密集程度特别高时才进行传代，如果一直这样，不仅会缩短传代时间，导致操作密集；同时细胞的老化会更加严重。另外，细胞死亡时释放DNA，会“抓住”其他细胞，形成黏性的细胞团，若不及时处理，整体细胞状态会恶性循环。
- 聚团细胞状态都不好吗
若细胞轮廓清晰，胞体通透，呈串状均匀聚集，证明其状态较好，正在分裂。但是大多数情况下，聚团细胞都是轮廓模糊，细胞透光性差，甚至出现合胞体，同时伴有细胞碎片，这证明细胞已经衰老或者产生病变，状态不佳。
- 如何避免聚团细胞的生成
首先确认当前细胞生长密度及状态，80%左右的生长密度即可进行传代，此时细胞状态较好，且用于传代的数量也足够。
传代操作前，使用缓冲液对细胞进行适当且全面地润洗，清除死亡的细胞团和部分堆叠杂质（在选择适当胰酶浓度时，对于不同代数的不同细胞系需进行一定的调整，如：部分贴壁牢固的细胞应将胰酶分装后，进行预热处理；细胞密度过高时，应该向胰酶中加入少量缓冲液，缓慢均匀地消化细胞等。对于贴壁格外牢固的细胞，可以尝试多次分批进行消化，最大限度保证细胞状态）。
在消化过程中，需均匀慢速晃动培养器皿，以免局部胰酶浓度过高而影响传代。切勿用力摇动，导致边缘松动的大片细胞直接脱落，从而增加细胞成团几率。
培养器皿的选择也需注意，部分实验室会使用玻璃培养瓶，因细胞贴壁在玻璃底更容易分离。同时玻璃材质的亲水性和塑料有区别，而且玻璃细胞培养瓶都是实验室内部处理，可能会有清洁残留，在一定程度上抑制细胞的贴壁生长，并且更容易消化，细胞之间的连接比贴壁还要紧密，聚团几率很大。
另外，避免传代过程中汇合度较大，本身1:3甚至1:4都可以正常培养的细胞被1:2传代，会导致母代细胞浓度过高，在分化过程中出现堆叠现象，所以在每次细胞传代前要对细胞进行计数。
- 已经聚团的细胞，只能弃掉吗
如果预实验比较紧急，或者细胞株较为珍贵，也可以在复苏新细胞的同时，进行聚团细胞“拯救”。
首先，将带有聚团细胞的样品低密度连续传代，约三代过后，可逐渐分散为独立个体，再通过监测细胞活力状态，判断是否可用来进行下游实验。若肉眼可见，即可直接通过清洗和吸出，或是在消化后将悬起的细胞样品静置数十秒以沉淀团块。对于死细胞聚团，可以在细胞液中适量加入DNase以断裂DNA。
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