病原微生物的分类

根据病原微生物的传染性、感染后对个体或者群体的危害程度，将病原微生物分为四类，第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。

第一类病原微生物：是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。我国目前规定的第一类病原微生物全是病毒，没有细菌，如高致病禽流感病毒、非洲猪瘟病毒、天花病毒、刚果热病毒、埃博拉病毒、委内瑞拉病毒、黄热病毒等，共计29种病毒。

第二类病原微生物：是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。如狂犬病病毒，此次新型冠状病毒暂按照第二类病原微生物进行管理。炭疽芽孢杆菌、布氏杆菌等也属于第二类病原微生物。

第三类病原微生物：是指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。

第四类病原微生物：是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。

根据卫生部《人间传染的病原微生物名录》要求,拟从事的病原微生物实验活动应与对应的生物安全防护水平相适应。

安全级别：

根据对人体安全的潜在威胁，可分为4个级别。

1级：基本对人体不致病，一般超净台即可操作；

2级：对人体条件致病，不传染，但需在二级生物安全柜操作，感染后可以有效治疗；

3级：对人体严重致病，具有传染性，可以有效治疗；

4级：对人体严重致病，极具传染性，目前尚无有效治疗方法。

病原微生物的检测方式

为了提高各种疾病诊断、治疗效果，保障人们身体健康，就要求临床检验技术更加准确、快速。那么微生物检测技术有哪些呢？

传统检测方式

对病原微生物进行传统检测的过程中，大都需要进行染色、培养，并在此基础上进行生物鉴定，以便能够鉴别不同种类的微生物，检测价值较高。传统检测方式主要包括涂片镜检、分离培养与生化反应、组织细胞培养三种。

1 涂片镜检

病原微生物体形体积微小，大多无色半透明状，将其染色后可借助显微镜观察其大小、形态、排列等。直接涂片染色镜检简便快速，对那些具有特殊形态的病原微生物感染仍然适用，例如淋球菌感染、结核分枝杆菌、螺旋体感染等的早期初步诊断。直接进行涂片镜检的方式检查速度较快，能够对于形态特殊的病原体进行直观的检查，不需要特殊的仪器和设备，在基层实验室里仍然是十分重要的病原微生物检测手段。

2 分离培养与生化反应

分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。细菌的生长繁殖需要一定时间，检测周期较长，不能同时处理批量样本。所以医学领域不断对此进行了研究，采用了自动化的培养和鉴定的器械，对传统的培养方式进行了改善，提升了检测的准确性，也大大加快了检测速度。

3 组织细胞培养

组织细胞主要包括衣原体、病毒和立克次体等，由于不同的病原体内的组织细胞种类不同，所以从病原微生物中活体取出组织后需采用传代培养的方式进行活细胞的培养，进而再将培养的病原微生物接种到组织细胞中进行培养，以尽可能的减少细胞的病变。此外，也可以在培养组织细胞的过程中，可以将病原微生物直接在敏感动物体内接种，再根据动物的组织器官出现的改变对病原体的特质进行检验。

血清学检测

采用血清学检测能够对病原微生物进行快速鉴定，血清学检测技术的基本原理是通过已知的病原体抗原以及抗体对病原体进行检测，与传统的细胞分离培养相比，血清学检验的操作步骤简单，其常用的检测方法包括血清凝集技术、乳胶凝集实验、荧光抗体检测技术和酶联免疫测试技术等。酶联免疫测试技术的应用能够大幅度提高血清学检测的敏感性和特殊性，不仅能够对检测样本中的抗原进行检测，还能够检测抗体成分。

免疫学检测

免疫学检测又被称为免疫磁珠分离技术，该技术能够将病原体中的致病菌和非致病菌分离开，其基本原理为：利用磁珠微球将特定病原体的单一抗原或者多种抗原集合在一起，通过抗原体反应和外部磁场的作用，将致病菌从病原体中分离出来，目前我国已经研制出了多种具有针对性的免疫磁珠，例如有针对李斯特菌、大肠埃希氏菌和白色念珠菌等细菌的免疫磁珠。

基因检测技术

随着分子生物检测技术的发展，其能够有效地对病原微生物进行鉴定，病原微生物的核酸序列即基因片段都是特异的，有别于其他种或属，检测其特有的基因片段序列对病原微生物的种类进行鉴别，所以基因检测技术以其自身独到的优势被临床医学检验领域广泛应用。

1 聚合酶链反应（PCR）

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种在体外是用已知寡核苷酸引物引导未知片段中微量待测基因片段并进行扩增的技术。由于PCR可以对待测基因进行扩增，特别适用于病原体感染早期的诊断，但是如果引物特异性不强，可能会造成假阳性的出现。PCR技术在近20年里发展迅速，从基因扩增到基因的克隆和改造以及遗传分析，可靠性逐步提高。该方法也是本次疫情新冠病毒的主要检测方法。

1988年Chamberian等提出了多重PCR的概念，同一PCR反应体系里加上两对以上引物，可同时扩增出多个核酸片段，适合大量样本的分析与鉴定。

多重PCR具有：

(1)高效性，在同一反应体系内可同时检出多种病原微生物，或对同一病原微生物的不同型别进行分型；

(2)系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如几种肝炎病毒同时感染；淋球菌、梅毒螺旋体、艾滋病病毒等多重性病病原体的感染；需特殊培养的无芽胞厌氧菌感染；破伤风杆菌，炭疽杆菌，产气荚膜杆菌，鼠疫耶尔森菌等战伤感染细菌感染；

(3)经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时被检出，节省试剂、节约费用、节省时间，为临床提供更快更多更准确的诊断信息。实时荧光定量PCR，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。具有高度灵敏、高度特异、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时荧光定量PCR对性病病原体早期确诊、窗口期筛查、疗效检测、基因变异分析和预后评估等具有重要价值，为流行病学调查提供帮助。荧光基团标记的特异性引物可准确反映病原体感染和药物疗效，特别适用于不可人工培养和难以培养的病原体如病毒、衣原体等感染的诊断。基因芯片技术与多重PCR结合可以通过PCR对目的基因进行放大，通过基因芯片的荧光探针增加检测的灵敏性和特异性，使得两种检测技术的优势互补，已广泛应用于病原微生物的检测。将病原体特异性基因作为靶基因设计出引物与探针，进行多重PCR扩增，制备出寡核苷酸芯片，再对待测样本靶基因进行多重PCR扩增，将扩增产物与病原菌多重PCR基因芯片检测体系杂交，可根据杂交信号直观地判读样品中所含病原体的种类、型别、毒力、侵袭力，从而对病原体进行检测和鉴定。

2 基因芯片技术

基因芯片(Gene chip)又称为DNA微阵列(DNA

microarray)或DNA芯片，是指通过微阵列技术将高密度DNA片段通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等研究。将基因芯片技术应用到病原微生物的诊断中，可明显缩短诊断时间，同时还能检验出病原体是否存在耐药性，以及对哪些药物耐药，对哪些药物敏感等，从而为临床用药提供参考。但是该项技术的制作成本较高，芯片检测的敏感性也需提高，所以该项技术还主要用于实验室研究，未能在临床中得到广泛应用。

3 核酸杂交技术

核酸杂交是病原微生物中具有互补序列的核苷酸单链在细胞内融合形成异质双链的过程，导致发生杂交的因素是核酸与探针发生化学反应，从而对病原微生物进行鉴定。目前用于对病原微生物进行检测的核酸杂交技术主要有核酸原位杂交和膜上印迹杂交。核酸原位杂交是指病原体细胞中的核酸与标记探针进行杂交。膜上印迹杂交是指将病原体细胞的核酸分离出后，将其进行纯化后与固相支持物相结合，然后与核酸探针进行杂交。核酸杂交技术具有操作方便、快速的优点，而且适用于敏感、特异的病原微生物。

4 其它基因检测技术

分子生物学技术飞速发展，各种新的基因检测手段不断出现。环介导恒温核酸扩增法(1oop-mediated isothermal amplification of DNA，简称LAMP)，针对靶基因序列上6或8个特异区域设计出4或6条引物，在具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下形成环状结构和链置换对目标DNA大量扩增。目前几年LAMP已被广泛应用于疾病诊断、环境监测、食品检验、生物安全等各方面。多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple Locus Variable-number tandem repeat Analysis，MLVA)是一种根据病原体基因组中可变数目串联重复序列的特征来对病原体基因分型的一种技术，广泛应用于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、炭疽芽胞杆菌等的基因分型与鉴定。

近年来，随着医疗技术的不断发展，各种病原微生物高通量检测技术可达到准确度更高、敏感度更好、快速省时、无污染、简单方便的特点，

这些技术和方法必将发挥越来越重要的作用，为将来病原微生物的诊断分析和防治打下坚实的技术基础。