小胶质细胞是神经系统中的巨噬细胞，可介导脑稳态和神经炎症。作用至关重要，但在大脑发育中具体机制尚未完全阐明。这篇文章中，通过对比健康成人和炎症激活(构建的实验性自身免疫性髓鞘炎模型EAE)的细胞群，发现新生鼠的小胶质细胞对于髓鞘生成及神经形成起关键作用。其中CD11c +小胶质细胞亚群在发育中大脑的髓鞘区域高表达，介导神经和胶质细胞的存活，迁移和分化。这些细胞是IGF1的主要来源，而选择性耗竭会该亚群可导致性髓鞘形成受损。 引用Jimmy的话：
值得一提的是，在单细胞水平研究小神经胶质细胞（Microglia）动态发育和异质性已经有了不少研究。
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波士顿儿童医院的研究者们分析了超过76,000个来自于发育、衰老和脑部感染后的小鼠脑部的小胶质细胞，结果表明至少有9种转录特异的小胶质细胞形态，它们可以表达特定的基因集，且位于特定的脑区。发表于免疫学杂志Immunity， doi:10.1016/j.immuni.2018.11.004 (2019).
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斯坦福大学医学院的研究者采用高深度scRNA测序揭示了小胶质细胞和脑髓细胞的发育异质性，发表于Neuron，这些细胞取自于胚胎期、出生后早期和成年的小鼠不同脑区。我们发现大部分的成年小胶质细胞表达稳定的基因（homeostatic genes），且不同脑区间没有差异。相反，出生后早期的小胶质细胞异质性更高。doi:10.1016/j.neuron.2018.12.006 (2019).
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德国弗莱堡大学医学院神经病理学研究所的研究者采用单细胞RNA测序揭示小鼠和人的小神经胶质细胞的空间和时间异质性，成果最近以Letter的形式发表于Nature杂志。doi:10.1038/s41586-019-0924-x (2019).
这些都是当前的脑发育研究的热点和前沿！（Jimmy老师，你知识怎么能这么渊博？我这个搞神经发育的都惭愧【捂脸】）
文章课题设计
该文章对五个处理组，共17个老鼠：
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orange represents neonatal CD11c+ microglia (n = 4),
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green neonatal CD11c microglia (n = 4),
-
blue EAE CD11c+ microglia (n = 3),
-
purple EAE CD11c microglia (n = 3),
-
black adult microglia (n = 3).
其实就是 neonatal(新生的) 和 EAE的Microglia，还有CD11C阳性和阴性，然后和成年小鼠的Microglia进行比较。这些样本进行了RNASeq测序，数据在GEO可供下载：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78809。当然我偷了个懒，该文章Supplemental material提供了整理之后的csv矩阵，大概1万3千个基因。
作者进行了WGCNA分析，以此证明小胶质细胞的作用及寻找关键信号通路及基因（嗯，估计这个实验室后续还有大文章出来）。
组学及生信分析的篇幅占了整个文章的一半以上。在此，仅重复文章的Figure3。
其实我跌跌撞撞学了WGCNA半个月，大概了解了这个原理，现在还一知半解，对很多细节摸索了很久，头很大。下面进入正题，请大家一起跟着我头大。
1.数据处理
rm(list = ls())dev.off()library(WGCNA)
结果如图：
image
<figcaption style="margin: 10px 0px 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; word-wrap: break-word !important; line-height: inherit; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153); font-size: 0.7em;">
</figcaption>
这结果挺好的，符合实验设计，都聚类好了。**但是！但是如果不对原始数值进行log2处理，会出现一个outlier老鼠**，如图：
image
看到没，那个新生的NEO1号鼠有点调皮！他超脱于所有老鼠之上，统领其他所有老鼠！**这要么是问题少年，要么是智商超群，比如科大少年班的那种！**而我大概深究了一下，控制这个离群值的大概是500个基因，哈哈哈。。。
2. MDS分析
专业名词叫多维标度法（Multidimensional Scaling）MDS，是一种维数缩减方法，把高维的数据点映射到一个低维的流形上；同时也是一种可视化方法，实践中通常利用2D或3D的MDS 结果观察（投影后）点的分布和聚集来研究数据的性质。实际上你也可以把它看做是PCA分析，反正都是看样本间的相关性计算距离远近。
说人话叫做：通过基因表达log2组间差异，看看这17个老鼠是否能够分到一个类别，比如成年鼠归到一类，EAE归到一类，新生鼠归到一类。和上面的有点类似，又不完全一样。
参考学习了stat的视频，也参考了他提供的代码。如下：
rm(list = ls())load(file = 'input.Rdata')log2.data.matrix <- as.data.frame(t(datExpr))## now create an empty distance matrixlog2.distance.matrix <- matrix(0, nrow=ncol(log2.data.matrix), ncol=ncol(log2.data.matrix), dimnames=list(colnames(log2.data.matrix), colnames(log2.data.matrix)))## now compute the distance matrix using avg(absolute value(log2(FC)))for(i in 1:ncol(log2.distance.matrix)) { for(j in 1:i) { log2.distance.matrix[i, j] <- mean(abs(log2.data.matrix[,i] - log2.data.matrix[,j])) }}## do the MDS math (this is basically eigen value decomposition)## cmdscale() is the function for "Classical Multi-Dimensional Scalign"mds.stuff <- cmdscale(as.dist(log2.distance.matrix), eig=TRUE, x.ret=TRUE)save(mds.stuff,file = "step7_MDS.Rdata")## calculate the percentage of variation that each MDS axis accounts for...mds.var.per <- round(mds.stuff$eig/sum(mds.stuff$eig)*100, 1)## now make a fancy looking plot that shows the MDS axes and the variation:mds.values <- mds.stuff$pointsmds.data <- data.frame(Sample=rownames(mds.values), X=mds.values[,1], Y=mds.values[,2])## 然后画图library(ggpubr)library(ggplot2)groups <- datTraits$grouppng("figures/step7_MDS_logfc.png",width = 800,height=600)ggplot(mds.data, aes(x=X, y=Y, label=Sample,col=groups)) + geom_point(size = 10, alpha = 0.8) + theme(panel.grid.minor = element_blank()) + coord_fixed() + theme_bw()+ ggtitle("MDS plot using avg(logFC) as the distance")+ xlab(paste("Leading logFC dim1 ", mds.var.per[1], "%", sep="")) + ylab(paste("Leading logFC dim2 ", mds.var.per[2], "%", sep="")) + ggtitle("MDS plot using avg(logFC) as the distance")dev.off()
结果如下：
image
<figcaption style="margin: 10px 0px 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; word-wrap: break-word !important; line-height: inherit; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153); font-size: 0.7em;">
</figcaption>
嗯，，，结果表示完美！**别问我为什么要先做这个图**，因为它好看，我忍不住！
点评：老米在这里开始秀技术了，实际上大家随便跑一下PCA分析即可，暂时无需深入写这么长代码！
** 下面正式进入WGCNA分析。**
3. 计算beta值
这个没啥好讲的，代码如下：
rm(list = ls())library(WGCNA)load(file = "input.Rdata")dim(datExpr)#################################################if(T){ powers = c(c(1:10), seq(from = 12, to=30, by=2)) # Call the network topology analysis function sft = pickSoftThreshold(datExpr, powerVector = powers, verbose = 5) png("figures/step2-beta-value.png",width = 800,height = 600) # Plot the results: ##sizeGrWindow(9, 5) par(mfrow = c(1,2)); cex1 = 0.9; # Scale-free topology fit index as a function of the soft-thresholding power plot(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2], xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Scale Free Topology Model Fit,signed R^2",type="n", main = paste("Scale independence")); text(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2], labels=powers,cex=cex1,col="red"); # this line corresponds to using an R^2 cut-off of h abline(h=0.9,col="red") # Mean connectivity as a function of the soft-thresholding power plot(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Mean Connectivity", type="n", main = paste("Mean connectivity")) text(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], labels=powers, cex=cex1,col="red") dev.off()}sft$powerEstimate ## beta=22 SCI文章里面用了20save(sft,file = "step2_beta_value.Rdata")
image
<figcaption style="margin: 10px 0px 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; word-wrap: break-word !important; line-height: inherit; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153); font-size: 0.7em;">
</figcaption>
4. 采用一步法构建加权共表达网络
(weight co-expression network)
rm(list = ls())library(WGCNA)load(file = "input.Rdata")load(file = "step2_beta_value.Rdata")enableWGCNAThreads()if(T){ net = blockwiseModules( datExpr, power = sft$powerEstimate, maxBlockSize = nGenes, TOMType = "unsigned", minModuleSize = 30, reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.28, ## 注意这个0.28 numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE, saveTOMs = F, verbose = 3 ) table(net$colors) }##模块可视化，画那个传说中的树if(T){ # Convert labels to colors for plotting moduleColors=labels2colors(net$colors) table(moduleColors) # Plot the dendrogram and the module colors underneath png("figures/step3-genes-modules.png",width = 800,height = 600) plotDendroAndColors(net$dendrograms[[1]], moduleColors[net$blockGenes[[1]]], "Module colors", dendroLabels = FALSE, hang = 0.03, addGuide = TRUE, guideHang = 0.05) dev.off()}save(net,moduleColors,file = "step3_genes_modules.Rdata")
结果如下：
image
<figcaption style="margin: 10px 0px 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; word-wrap: break-word !important; line-height: inherit; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153); font-size: 0.7em;">
</figcaption>
这里需要停顿一下：SCI文章只取到8个模块，图注说用了12691个基因（被我发现全部加起来也才9999，没错！9999个基因）。事实上，能够分这么少模块，我不知道作者参数细节。**有两个参数特别影响模块大小：**
-
一个是minModuleSize，表示每个模块里面最少放多少个基因，这很好理解，设定越大，模块越少；
-
另一个是mergeCutHeight，这个参数表示你在哪里砍树。值设定越小，树枝越多，通常是0.25。
google一下，发现这么一个说法：
I am not aware of a principle from which
这里，**我的mergeCutHeight = 0.28，最终取到13个模块！**
5. 模块与基因与表型
5.1 模块和老鼠表型对应
这是关键，其实就是开始解读这些关联的基因群对老鼠表型的影响，比如敲除CDC11之后的老鼠，哪些信号通路激活或抑制，EAE的老鼠哪些基因激活？等等等。
rm(list = ls())library(WGCNA)load(file = "input.Rdata")load(file = "step2_beta_value.Rdata")load(file = "step3_genes_modules.Rdata")if(T){ nGenes = ncol(datExpr) nSamples = nrow(datExpr) design <- model.matrix(~0+datTraits$group) colnames(design)= levels(datTraits$group) ## get the group MES0 <- moduleEigengenes(datExpr,moduleColors)$eigengenes MEs = orderMEs(MES0) moduleTraitCor <- cor(MEs,design,use = "p") moduleTraitPvalue <- corPvalueStudent(moduleTraitCor,nSamples) textMatrix = paste(signif(moduleTraitCor,2),"\n(", signif(moduleTraitPvalue,1),")",sep = "") dim(textMatrix)=dim(moduleTraitCor) png("figures/step4-Module-trait-relationship.png",width = 800,height = 1200,res = 120) par(mar=c(6, 8.5, 3, 3)) labeledHeatmap(Matrix = moduleTraitCor, xLabels = colnames(design), yLabels = names(MEs), ySymbols = names(MEs), colorLabels = FALSE, colors = blueWhiteRed(50), textMatrix = textMatrix, setStdMargins = FALSE, cex.text = 0.5, zlim = c(-1,1), main = paste("Module-trait relationships")) dev.off() save(design,file = "step4_design.Rdata")}
通过模块与各种表型的相关系数，可发现自己感兴趣的模块。如图：
image
可以看到有些模块与成年鼠关联，有些与EAE相关性很高。和原SCI的图有点像。
5.2 各模块与表型相关性bar图
就是上面的图转化成bar图。
if(T){ mes_group <- merge(MEs,datTraits,by="row.names") # 小技巧，可以通过rowname进行merge ##写了个画图的function library(gplots) library(ggplot2) library(ggpubr) library(grid) library(gridExtra) draw_ggboxplot <- function(data,gene="P53",group="group"){ #print(gene) ggboxplot(data,x=group, y=gene, ylab = sprintf("Expression of %s",gene), xlab = group, fill = group, palette = "jco", #add="jitter", legend = "") +stat_compare_means() } ###开始批量画boxplot colorNames = names(MEs) png("figures/step4-expression-group.png",width = 800,height=2000,res = 120) #par(mfrow=c(ceiling(length(colorNames)/2),2)) p <- lapply(colorNames,function(x) { draw_ggboxplot(mes_group,gene= x,group="group") }) do.call(grid.arrange,c(p,ncol=2)) dev.off()}
部分结果如下：
image
5.3 模块与基因的相关性
if(T){ modNames = substring(names(MEs), 3) geneModuleMembership = as.data.frame(cor(datExpr, MEs, use = "p")) ## 算出每个模块跟基因的皮尔森相关系数矩阵 ## MEs是每个模块在每个样本里面的值 ## datExpr是每个基因在每个样本的表达量 MMPvalue = as.data.frame(corPvalueStudent(as.matrix(geneModuleMembership), nSamples)) names(geneModuleMembership) = paste("MM", modNames, sep="") names(MMPvalue) = paste("p.MM", modNames, sep="") geneTraitSignificance <- as.data.frame(cor(datExpr,datTraits$groupNo,use = "p")) GSPvalue <- as.data.frame(corPvalueStudent(as.matrix(geneTraitSignificance),nSamples)) names(geneTraitSignificance)<- paste("GS.",names(datTraits$group),sep = "") names(GSPvalue)<-paste("GS.",names(datTraits$group),sep = "") #selectModule<-c("blue","green","purple","grey") ##可以选择自己喜欢的模块 selectModule <- modNames ## 也可以批量作图 png("figures/step4-Module-trait-significance.png",width = 800,height=2000,res = 120) par(mfrow=c(ceiling(length(selectModule)/2),2)) #批量作图开始 for(module in selectModule){ column <- match(module,selectModule) print(module) moduleGenes <- moduleColors==module verboseScatterplot(abs(geneModuleMembership[moduleGenes, column]), abs(geneTraitSignificance[moduleGenes, 1]), xlab = paste("Module Membership in", module, "module"), ylab = paste("Gene significance for", module, "module"), main = paste("Module membership vs. gene significance\n"), cex.main = 1.2, cex.lab = 1.2, cex.axis = 1.2, col = module) } dev.off()}
截取部分如下：
image
5.4 关注感兴趣的模块，导出基因进行GO分析
rm(list = ls())library(WGCNA)load(file = 'input.Rdata')load(file = "step2_beta_value.Rdata")load(file = "step3_genes_modules.Rdata")load(file = "step4_design.Rdata")load(file="step4_datTraits.Rdata")table(moduleColors)group_g <- data.frame(gene=colnames(datExpr), group=moduleColors)write.csv(group_g,file = "figures/group_g.csv") ## 导出了对应模块所有基因# 选择mouse的基因组进行注释及ID转化啥的，如果是人的，另有R包if(!require("clusterProfiler")) BiocManager::install("clusterProfiler",ask = F,update = F)library(clusterProfiler)if(!require("org.Mm.eg.db")) BiocManager::install("org.Mm.eg.db",ask = F,update = F)library(org.Mm.eg.db)tmp <- bitr(group_g$gene,fromType = "ENSEMBL", toType = "ENTREZID", OrgDb = "org.Mm.eg.db")de_gene_cluster <- merge(tmp,group_g,by.x="ENSEMBL",by.y="gene")table(de_gene_cluster$group)###run go analysisformula_res <- compareCluster( ENTREZID~group, data = de_gene_cluster, fun = "enrichGO", OrgDb = "org.Mm.eg.db", style="margin: 0px; padding: 0px; font-size: inherit; line-height: inherit; color: rgb(80, 161, 79); overflow-wrap: inherit !important; word-break: inherit !important;">"BP", pAdjustMethod = "BH", pvalueCutoff = 0.01, qvalueCutoff = 0.05)lineage1_ego <-simplify( formula_res, cutoff=0.5, by="p.adjust", select_fun=min)save(group_g,formula_res,lineage1_ego,file="step5_GOananlysis.Rdata")#出图pdf("figures/step5_Microglia_GO_term_DE.pdf",width = 15,height = 15)dotplot(lineage1_ego,showCategory=10)dev.off()write.csv(lineage1_ego@compareClusterResult, file="figures/Microglia_GO_term_DE.csv")
GO结果分析如下：
image
通过与上面的几个图表配合，发现EAE鼠与炎症通路/免疫相关，而新生鼠的胶质细胞则是cell cycle/胶质细胞分化/神经细胞发育/轴树突形成通路相关。与原SCI分析相符，与预期相符。
5.5 画WGCNA的标配热图
rm(list = ls())library(WGCNA)load(file = 'input.Rdata')load(file = "step2_beta_value.Rdata")load(file = "step3_genes_modules.Rdata")load(file = "step4_design.Rdata")load(file="step4_datTraits.Rdata")load(file="step5_GOananlysis.Rdata")# 主要是可视化 TOM矩阵，WGCNA的标准配图# 然后可视化不同 模块 的相关性 热图# 不同模块的层次聚类图# 还有模块诊断，主要是 intramodular connectivityif(T){ #geneTree = net$dendrograms[[1]] TOM=TOMsimilarityFromExpr(datExpr,power=20) dissTOM=1-TOM #plotTOM = dissTOM^7 #diag(plotTOM)=NA #TOMplot(plotTOM,geneTree,moduleColors,main="Network heapmap plot of all genes") ### 我这里只取了1000个基因哈，我试了一下全部基因，结果跑了半个小时没跑完，被我强行退出！ nSelect =1000 set.seed(20) select=sample(nGenes,size = nSelect) selectTOM = dissTOM[select,select] selectTree = hclust(as.dist(selectTOM),method = "average") selectColors = moduleColors[select] plotDiss=selectTOM^7 diag(plotDiss)=NA png("figures/step6_select_Network-heatmap.png",width = 800,height=600) TOMplot(plotDiss,selectTree,selectColors,main="Network heapmap of selected gene") dev.off()}
如下：
image
5.6 提取指定模块的基因并做热图
if(T){ module="turquoise" which.module=module dat=datExpr[,moduleColors==which.module] library(pheatmap) pheatmap(dat,show_colnames = F,show_rownames = F) n=scale(t(dat+1)) # 'scale'可以对log-ratio数值进行归一化 n[n>2]=2 n[n< -2]= -2 n[1:4,1:4] pheatmap(n,show_colnames =F,show_rownames = F) group_list=datTraits$group ac=data.frame(g=group_list) rownames(ac)=colnames(n) png("figures/step6-moduleGene-heatmap.png",width = 800,height = 600) pheatmap(n,show_colnames =F,show_rownames = F,annotation_col =ac ) dev.off()}
image
<figcaption style="margin: 10px 0px 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; word-wrap: break-word !important; line-height: inherit; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153); font-size: 0.7em;">
</figcaption>
都挺好的。
点评：这个热图有问题，具体代码是 n=scale(t(dat+1)) 里面少了一个转置！
5.7 性状与模块的关系
if(T){ ## 连续性的变量，如体重等才好和模块进行比较。 MEs=moduleEigengenes(datExpr,moduleColors)$eigengenes MET = orderMEs(cbind(MEs,datTraits$groupNo)) par(cex = 0.9) png("figures/step6-Eigengene-dendrogram.png",width = 800,height = 600) plotEigengeneNetworks(MET, "", marDendro = c(0,4,1,2), marHeatmap = c(3,4,1,2), cex.lab = 0.8, xLabelsAngle = 90) dev.off()}
如图：
image
6. 模块导出
感兴趣的模块导出到cytoscape，VisANT等软件进一步进行可视化分析。
#######gene export for VisANT or cytoscapeif(T){ module="turquoise" probes = colnames(datExpr) inModule = (moduleColors==module) modProbes=probes[inModule] head(modProbes) modTOM = TOM[inModule,inModule] dimnames(modTOM)=list(modProbes,modProbes) ### 这里只选了top100的基因 nTop=100 IMConn = softConnectivity(datExpr[,modProbes]) top=(rank(-IMConn)<=nTop) filterTOM=modTOM[top,top] # for visANT vis = exportNetworkToVisANT(filterTOM,file = paste("figures/visANTinput-",module,".txt",sep = ""), weighted = T,threshold = 0) # for cytoscape cyt = exportNetworkToCytoscape(filterTOM, edgeFile = paste("figures/CytoscapeInput-edges-", paste(module, collapse="-"), ".txt", sep=""), nodeFile = paste("figures/CytoscapeInput-nodes-", paste(module, collapse="-"), ".txt", sep=""), weighted = TRUE, threshold = 0.02, nodeNames = modProbes[top], nodeAttr = moduleColors[inModule][top])}
总结
至此，复现结束。如果你仔细的看到了这里，说明你是想学WGCNA的了。回到课题本身，是否对小胶质细胞的认识更近了一步？提个小小的科学问题：**在PD中，是否有一个胶质细胞亚群可对MPP+诱导的黑质神经细胞死亡有抵抗和保护作用**？哈哈，别说我是搞肿瘤的了。。。
这些内容，换个思路应该够一个硕士毕业了。。。
写完又是深夜【捂脸】。还在持续学习中fighting。。。
能跟下来这篇教程的前提是你学习过R语言，否则一切都是镜中花水中月！
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