今天，分享一篇浙大樊老师和华大发表在Developmental Cell 上的，题目是“Spatiotemporal transcriptomic landscape of rice embryonic cells during seed germination”的文章。这个paper里利用单细胞和华大stereo-seq构建了水稻种胚的空间转录图谱。

Spatiotemporal transcriptomic landscape of rice embryonic cells during seed germination

=====实验设计=====

基于水分吸收和生理变化，作者把水稻种子吸胀之后的萌发分为三个阶段：0-24、24-48、48-72小时（HAI）。其中转录变化最显著的发生在0-24和24-48 HAI。所以作者取样的话，取了4个时间点：6、24、36、48 HAI。

=========结果==========

结果1：产生了水稻种胚的高质量单细胞和空间转录组数据

基于华大的stereo-seq收集了4个切片中的52个种胚组织切片，并利用华大可视化系统STOmics进行展示，用户可以通过他们的网址进行访问：http://ibi.zju.edu.cn/REGSTA/。

4个芯片上每个bin50上包含大约1200 UMI，平均基因数目为583个。为了避免不同时间点之间/采样之间的批次效应，作者最后从52个切片中选取了14个切片（分别来自6、24、36和48 HAI的4、4、3、3）进行后续的分析（附图1A）。

同时作者，还对4个时间点的样品进行了单细胞测序（图1A），总共获得了27099个细胞。过滤之后，获得了27070个细胞，包含37458个基因。从单细胞数据和空转数据的相关性来看，大概在0.5左右，可能主要是由于在原生质体准备过程中酶切造成的（附图1B）。

附图1

总的来说，作者从14个切片4个时间点样本中获得了高质量的空间转录组数据，同时获得了包含27070个细胞的单细胞数据，使得作者可以去探索在水稻发芽过程中的时空转录规律。

图1

结果2：水稻胚乳的细胞自动分割

为了有效捕获每个cell的RNA，作者构建了一个自动化的胚乳细胞分割流程。作者首先使用FB染色技术可视化细胞壁。为了评估细胞分割的准确性，作者创建了一个具有清晰细胞壁染色信息的图像集作为训练数据。然后通过一些参数，比如DICE指数、预测和实际之间的面积，来平复细胞切割模型的准确性（图1B）。在测试的几个模型中，CP_embryo具有最高的准确性（图1C，1D）。和以往的bin模型（窗口模型）相比，作者这个流程可以检测出更多的cell，每个cell中有较少的基因数目。
并且，作者发现，使用细胞分割法，有助于减轻组织空隙对数据结果的影响。例如空隙中基因的表达和环境更为相似，而不是其它组织区域（图1E）。同时，细胞分割方法更有助于查看不同区域细胞尺寸的差异，因为水稻胚乳中的细胞尺寸差异较大。例如SCL2是最大的细胞，直径大约30mm，而PL和RA的细胞最小，直径仅仅为10um。而通过bin50方法发现PL区域的cell数目为9.2个，SC区域的cell数目为0.88。考虑到不同细胞的尺寸，每个bin的大小大概为25um，bin方法只能作为参考而已。

结果3：空间聚类以及细胞类型分类

根据组织学上的特征以及空间信息，作者把水稻的胚乳分成了5个区域（PL、RA、CO、SC和EP-CR）（图2A）。作者首先用Seurat进行了无监督空间聚类，以24 HAI的样品为例，基于bin聚类后，获得了13个不同细胞簇（图2A）。然后把这些簇映射到空间信息上，5个区域可以被分成13个细胞类型：PL、COL1，COL），RA，RAL3，EPCR，EP-CRL），LS，SCL1，SCL2，SCL1-2、SCL3，以及BESCL2。从空间分布来看，细胞类型和空间位置还是比较一致的（图2A）。根据以往其它胚乳切片的信息，还多一个细胞类型RC（root cap），所以总共有14个细胞类型。作者推断RC应该在4个时间点都存在的，但是由于截面角度问题，并不是所有时间点都能看到RC的结构。

基于作者建立的细胞分割流程，也基于无监督的方法进行了聚类和注释，并和bin的方法进行了比较。细胞分割方法总共捕获了5693个细胞，远高于bin方法的2398（图2B）。每个细胞平均检测的基因数目则是bin方法高于细胞分割，分别是649和163。基于聚类的分割方法，可以鉴定出上面13个细胞类型的9个（图2A）。这些结果表明，这两种方法都可以用于细胞类型的鉴定。基于Bin方法，不同细胞类型之间的reads数量有明显的差异。而基于细胞分割方法，则没有明显的差异。
为了确保细胞类型注释的准确性，作者验证了一些以往报道过的marker基因，例如qLTG3-1，已知在CR和EP区域表达。此外，通过不同细胞类型的差异分析，作者鉴定了不同细胞类型许多新的标记基因（图2C）。并通过 ISH验证了部分基因（图2D）。
作者发现LTP不同member具有细胞类型特异表达的特征。例如，OsLTP1.15和OsLTP1.2，参与调节细胞分裂，在PL中特异表达；OsLTP2.6主要在COL2中表达；OsHyPRP14/20是特异性的在EP-CR中表达。原位杂交（FISH）也证明OsHyPRP14在EP-CR区域中特异性且高度表达（图S2D）。OsLTP1.18、LTP、OsLTPG22，参与种子脂质的存储，主要在COL1中表达。这些结果表明不同的LTP通过调节脂质代谢在不同的细胞类型中发挥着不同的作用（图2E）。
有一些基因则在胚乳的特定细胞类型表达。例如OsLEA20， 编码一种晚期胚胎发生丰富的（LEA）蛋白，在RA中特异表达（图2E）。长链脂肪酸编码基因ONI1，与芽发育有关，在COL1中具有特定的表达模式。此外，一个同源基因CER1（OsCER1），调节花药发育和水稻质体分化，在发芽胚胎的PL中特异表达。GO富集结果表明，“DNA包复合体”等途径（p=4.39E 4）和“染色质的组装或拆卸”（p＝2.19E4）在PL中富集，这意味着PL具有比较高的增殖能力。

图2

结果4：SC区域细胞分裂和分化轨迹构建

从作者的分类来看，SC区域可以分成5个细胞类型（SCL1、SCL1-2、SCL1-3
SCL2、BESCL1-2和SCL3）。通过marker基因，作者鉴定了SCL1和SCL3（图3A）。编码半胱氨酸蛋白酶OsSAG12-1和α淀粉酶糖蛋白AMY1A在SCL1中特异表达（图3B）。SCL3代表SC中的维管束组织，由于切片的角度问题，这种细胞类型很难识别，作者幸运的在一些切片中看到这个类型（图3A）。有几个marker基因，比如SRZ1，编码锌指蛋白和SAMDC1，编码
S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶在SCL3中特异表达（图2C）。

除了已知的SCL1和SCL3之外，空间转录组数据表明还存在其它三种细胞类型，既SCL1-2、SCL2和BESCL2。SCL2包含多种薄壁细胞层，位于PL附近。作者也鉴定了SCL2中特异表达的基因，如Os11g0496500和OsMFT2，并用FISH验证了OsMFT2（图3C）。以往报道证明OsMFT2通过调控ABA合成来影响种子的萌发。时间序列的空间转录组数据也表明OsMFT2从6到48 HAI的表达逐渐降低。对比野生型，OsMFT2敲除株系的发芽率显著升高（图3D），既达到30%的发芽率敲除株系种子需要30小时，而WT则需要96小时。这一结果表明OsMFT2降低了种子的休眠时间。和RNA-seq的联合分析表明在敲除株系中SCL2的比例明显小于野生型（图3E）。这个结果说明OsMFT2是SCL2区域的一个特异基因。

从解剖图来看，BESCL2和SCL2面积明显大于SCL1-2。BESCL2主要在SCL2的两端。SCL1-2主要在SCL1和SCL2中间。作者用marker基因OsCYS9验证了这一结果（图3B）。

为了更好的解析这三类细胞类型的功能，作者整合单细胞数据构建了其发育轨迹（图3F），同时鉴定了发育轨迹上关键的差异基因（图3G）。从结果可以看出，早期的细胞类型主要是SCL1-2，主要是肽合成相关的基因。在中间状态的主要是种子成熟以及乙醛裂解酶活性相关的基因。随后，余环境响应相关的额基因开始富集，主要在BESCL2细胞。

图3

结果5：水稻种子萌发过程中的动态转录响应

作者接下来探索6、24、36、48不同时间点之间的动态差异。无监督聚类表明在所有的样本中有着相似的细胞类型构成（图4A），除了BESCL2、SCL3和EP-CRL1在6 HAI的样本中区分不开，RAL3在24-HAI样品中没有识别之外。不同重复之间的细胞比例没有明显差别，说明取样的稳定性。通过比较不同时间点之间的细胞比例，作者发现SCL2、RA、COL1、COL2有显著的变化（图4B）。随着时间推移，SCL2和LS的比例显著下降，而RA的比例则显著上升。
作者进一步使用Mfuzz的对不同细胞类型的4个时间点进行聚类，并鉴定了不同时间点的marker基因（图4C）。与细胞壁组成、微管相关的途径、气孔发育、芽系统形态发生、表皮形态发生的途径在萌发过程中持续升高（图4C）。温度和水的响应、阳离子结合和叶绿体包膜特征等相关的基因从6到24HAI剧烈下降，随后不变。细胞周期、ATP酶活性和有丝分裂和DNA修复相关的基因从36-HAI开始升高，这些结果意味中从36-HAI开始细胞增值和细胞周期开始加强。

图4

结果6：激素以及营养的细胞类型特异调控

在水稻种子萌发的过程中植物激素调节了营养代谢。通过结合空转和单细胞数据，作者发现生长素和GA以及脂质转运的基因从6-48时间点逐渐升高。而ABA则是显著下降。淀粉酶基因则是从6到36上升，然后下降（图5A）。这些结果和种胚萌发过程的RNA-seq的结果是一致的。空转数据使得我们可以探索不同细胞类型响应的差异。淀粉酶基因主要在SCL1和SCL-2中表达（图5B和5C）。通过查看激素信号，作者发现auxin合成相关的基因主要在PL和RA中高表达。而通过查看转录因子的情况，发现几个转录因子家族（NAC、LBD、HSF等）在PL和RA中特异表达，并且和auxin的pattern相反。GA主要在LS和EP-CR中高表达（图5B）。

图5