每篇文章首先阅读题目和摘要，看是否感兴趣，了解大致内容
然后看框架，每一部分都写了什么，考虑每一部分之间的逻辑关系，是递进、并列还是总分
看图
最后细读文章
阅读完一篇研究性质的文章需要掌握的是：
文章最想说明什么问题，
脉络是什么，画一个总的结构图，每一部分又有自己的脉络
新颖的地方是什么
使用了什么方法，软件
在哪几个层面做了实验
以Mucosal Profiling of Pediatric-Onset Colitis and IBD Reveals Common Pathogenics and Therapeutic Pathways为例
主要想说的是1. 单细胞测序方面 儿童IBD患者的黏膜各种细胞的基因表达谱以及TB细胞的TCR/BCR谱以及GWAS分析得到的风险基因。2.重点的围绕cAMP的各种机制及小鼠模型和人的治疗均有效果
脉络
RESULTS中
第一段 病人及正常对照标本的队列收集及基本资料、各类指标的特征；结肠微环境的单细胞测序谱
介绍收集患者队列的时间、基本信息、构成比例、做的检查。
其中17人进行单细胞RNA测序，免疫细胞单细胞VDJ富集实验，数据处理、质量控制，转录组数据将细胞分为9组，使用t-SNE图，用标记基因打标签。
使用GWAS确定基因对受损黏膜平衡的影响，加上基于基因的分析，确定244个可能导致IBD的基因。
第二段 PIBD病人的肠上皮细胞的风险基因
描述上皮细胞的特征，分成10个亚型。结肠干细胞、吸收细胞、分泌足细胞存在于三个未分化的簇中。等等各种细胞表达基因的特征。
然后把候选风险基因和干细胞、祖细胞类型重叠。
第三段 纤维母细胞和内皮细胞有丰富的炎症、基质重塑和一型干扰素特征
将纤维母细胞分成7个亚群，根据定义好的标记基因、转录因子、亚表皮定位和功能命名。介绍了每种细胞有的基因。
然后比较纤维细胞亚群的差异表达基因，发现WNT2B和炎症纤维母细胞富集TNF、NFKB和压力应答等等
比较对照和PIBD中的内皮细胞，发现血管生成和白细胞溢出血管有关。使用免疫荧光等证明PECAM1阳性的内皮细胞，还有内皮细胞内表达促进IBD中T细胞分化和适应的分子IL33。
第四段 骨髓细胞在肠粘膜聚集 有高炎症(相对重要）
PIBD中骨髓细胞更丰富，都表达CD68。重点来了，TNFα在PIBD肠粘膜中增加，PDE4B，表达PDE可以降低cAMP的酶，在TNFα阳性的巨噬细胞中高表达。使用PDE抑制剂双嘧达莫可以升高cAMP水平，抑制TNFα的表达。总的来说就是炎性体增加，可以被双嘧达莫抑制。
第五段 组织原位记忆B细胞和IgG浆细胞在PIBD中很多
CD19阳性的B细胞在肠炎增多，CD138阳性的浆细胞在UC 和 CD增多。分了7个亚群。
BCR分析揭示三种细胞的扩增，细胞状态转变分析显示BrmCD27产生主要的浆母细胞及浆细胞。还有IgA到IgG的转变。Ig变多，会促进IBD的发展。
比较正常对照和PIBD组的Brm亚群，发现没有明显的基因表达差异。但是在IGHA1表达的浆细胞中抑制NFKB活性的基因增加了，非经典NFKB激活对于IgA 的转换和表达十分重要。NFKBIA这个PIBD风险基因在IgA 浆细胞中高表达。
第六段 CD39+肠T细胞有细胞毒性和调节特征 在PIBD中少了
T 和NK 细胞，16个亚型 有趣的是CD8Trm和8T细胞有相似的整体表达程序，他们有不同的起源，可以区分，这应该是由共同的黏膜微环境决定的。
然后看分析发展关系，看TCR克隆扩增和发展转变分析。
分析疾病和健康组T/NK的组成亚群。发现CD8-ENTPD1，γ8T ENTPD1和CD8 ITGAETrm细胞在PIBD下降。ENTPD1编码CD39，可以吧ATP和ADP降解为AMP。免疫表型也确认PIBD表达CD39少了。
共表达分析发现GPR65和CD247、MAP3K8和CD39阳性相关（而不是与CD38）。在低PH炎症的时候降低cAMP的浓度。MAP3K8调节TCR和TNFα的ERK激活下游
在人类巨噬细胞中，CD39由cAMP-PKA-ERK通路的ATF2和CREB下游来引导。同时差异表达基因也发现PKA和ERK通路在CD 39阳性的细胞中富集。
Volcano plot showing the DEGs between the FACS-sorted bulk CD39+ CD8+ Trm and CD39- CD8+ Trm cells from children with colitis (n = 4). Red and navy dotsdenote individual genes passing P-value (%0.05) and log2(Fold Change) (red, R 1; navy, % 1) thresholds.
上面这个图说明了second-messenger-mediated
pathways regulate CD39 expression ？？
所以假设是酸性环境和多的TNFα造成有IBD风险基因的人群损伤CREB和ATF2，从而无法表达CD39（我自己想的是GPR65酸性环境，cAMP减少；还有一个是和TNF炎性环境和PDE有关系，PDE4B，表达PDE可以降低cAMP的酶，在TNFα阳性的巨噬细胞中高表达。影响cAMP-ERK途径，影响CREB和ATF2）
为了验证这个，在PUMC中取原始CD8T细胞，模拟炎症环境，使用双嘧达莫，看看和CD38有没有关系 。
分析风险基因，发现抗氧化基因MPST在ENTPD1 CD8中表达。cAMP信号也可以促进星形胶质细胞抗氧化应答。氧化应激可以造成UC的病例。因此ENTPD1的细胞可以发挥氧化平衡的保护作用。
再看是否CD39的表达下降会不会通过促进ATP和ADP积累来发挥作用。这个完全是用相关性分析，在分子层面看T细胞CD39的表达和结肠活检标本过夜ATP和ADP的释放量。有看了结肠活检标本，ADP和5HT的相关性。外周血分泌的5HT也多了。免疫荧光法又发现CD39和CD41负性相关。
第七段 试点用双嘧达莫恢复免疫平衡和减轻肠道炎症症状
总结PIBD的高炎症巨噬细胞和树突细胞、CD39肠内T损伤和徐小宝积累，导致cAMP降低可能是和这些有关系。
然后使用体内实验，DSS急性小鼠模型，在CD39和临床症状上有效。在人体重做了一个实验，临床症状，组织病理学、内镜编号，CD39增加了。ATF2和CREB也增加了，cAMP增加了。血小板少了，巨噬细胞浸润和TNF也少了。
后来又看了甲基强地松和抗TNFα
甲基强的松靶向血小板，有效，但是对免疫细胞没改变。TNF对血小板、免疫细胞都没有效果，可能是由于只靶向TNF的下游。
最后discuss
挑一点特别的点
除了是PDE抑制剂，双嘧达莫还有另一个相关功能，增加细胞外cAMP浓度，通过抑制细胞摄取。
CD73是一个可以将AMP转化为cAMP的东西，naive CD8,gd T, Brm, and epithelial cells产生
双- PDE--cAMP-PKA-ERK-CERB/ATF2-CD39-ADP/ATP-PLT
TNF
新颖的地方：
单细胞测序应用于儿童IBD
发现了以cAMP为中心的各种损伤，有单细胞分析得来，应用于细胞、小鼠、人层面均有效果，巨大的临床价值。
方法：
单细胞测序的方法
比较、聚类
分析的时候先用tSNE图二维表现出不同的细胞亚群
然后说明同一个细胞分别多少个病人有，比例特征例如某个病人没有某种细胞
然后对比病人和健康对照差异表达的基因 散点图
对比不同细胞的标志基因 热图
不同细胞的转录因子谱系 小提琴图 点图
不同细胞的危险基因表达 热图
TCR BCR的富集发现不同的免疫细胞 柱状图 发展过程 柱状图
拟时间轨迹图 一个基因在干细胞发展不同阶段的IUM？
分析通路图 TNF 刺激或者 相关数量
免疫荧光图 某个基因的表达 如CD39 41 等
箱式图 不同病人群体差异表达基因和差异的某种细胞
看治疗效果的柱状图
免疫组化图
肠镜图
饼状图说明基本情况
环状图 炎症因子 CRP等基本情况
流程图 开始和最后总结机制
免疫荧光
层面：
细胞层面
PUMC上的T细胞
小鼠层面
治疗
人的层面
治疗试点
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