为了寻找与COVID-19发病机制相关的潜在血清生物标志物，研究者对12例COVID-19患者和4名健康对照者的血清细胞外囊泡进行蛋白质组学研究；此外，还对10例COVID-19患者和5例健康对照患者的外周血进行了单细胞测序。单细胞测序结果显示，MACROH2A1的表达定位于单个核细胞；对肺组织的单核RNA测序显示，MACROH2A1在单个核细胞和巨噬细胞中高表达。此外，网络分析表明，多个通路包括：雌激素信号通路、p160类固醇受体共激活因子（SRC）信号通路和转录调控STAT等表达在外周血核肺单核细胞单核细胞中。总之，本研究结果表明，细胞外囊泡中的MACROH2A1是COVID-19的潜在生物标志物，可能是COVID-19的发病机制之一。
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文章题目：Next-generation proteomics of serum extracellular vesicles combined with single-cell RNA sequencing identifes MACROH2A1 associated with refractory COVID-19
中文题目：蛋白质组学结合单细胞RNA测序揭示血清细胞外囊泡中MACROH2A1-1与COVID-19的相关性
发表时间：2022.09
期刊名称：Inflammation and Regeneration
影响因子：10.426
实验技术：10x Chromium 单细胞转录组测序、DIA-MS、免疫组化、Western blotting
DOI：10.1186/s41232-022-00243-5.
研究内容
1、按COVID-19严重程度分析比较血清EVs蛋白质组学及鉴定MACROH2A1
本研究对12例COVID-19患者和4例健康对照者进行蛋白质组学分析，12例COVID-19患者分为三组：4例非危重（group 1）、4例危重和非难治（group 2）、4例危重和难治（group 3）。DIA非靶向蛋白质组学共检测到3046个蛋白，其中2376个为识别肽片段的蛋白。对危重病例（group 2和3）的比较发现了12个差异蛋白；此外，Ingenuity Pathway Analysis（IPA）发现了29个差异蛋白，并且主要富集在Th1-pathway。接下来进一步鉴别生物标志物，从而将难治性病例与危重症病例区分开来。根据疾病严重程度比较关键和非关键的蛋白质组（group 2、3 vs 1），结果鉴定出174个具有显著差异的蛋白。根据年龄和性别调整的线性回归分析中，发现了一种蛋白MACROH2A1按疾病严重程度显著增加，研究者推测该蛋白是预测难治性COVID-19最可能的生物标志物。
Fig.1 血清EVs蛋白质组学的比较分析及MACROH2A1的鉴定
2、MACROH-19重症患者血清EVs和肺组织中MACROH2A1的表达增强
蛋白质组学中MACROH2A1的表达在group 3中明显高于其他组，与血清EVs的WB结果相一致。对致死性COVID-19患者肺组织切片的免疫组化分析显示，肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞核中MACROH2A表达增加。因此，研究者确定MACROH2A是与难治性COVID-19发病机制密切相关的潜在生物标志物。
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Fig.2 MACROH-19重症患者血清EVs和肺组织中MACROH2A1的表达增强
3、scRNA-seq发现MACROH2A1在COVID-19危重患者的单个核细胞中表达增强
接下来，为了研究MACROH2A1在COVID-19危重患者中的作用，对3名非危重性和7名危重性（4名非难治性和3名难治性）患者的单个核细胞进行scRNA-seq，检测MACROH2A1在免疫细胞的表达情况。共获得了91,830个细胞，注释了9个细胞亚群。其中，MACROH2A1在单核细胞和树突状细胞中的表达水平特异性增强，此外，MACROH2A1的表达在危重病例中显著上调，而非危重病例仅在单核细胞中显著上调，提示MACROH2A1可能通过单核细胞参与严重SARS-CoV-2感染的发病机制。
Fig.3 scRNA-seq揭示高表达MACROH2A1的细胞类型
4、fatal COVID-19患者肺单核细胞和巨噬细胞中MACROH2A1的表达增强
接下来，对19例COVID-19患者和7例对照患者肺组织样本进行单核RNA测序（snRNA-seq），以进一步研究MACROH2A1在COVID-19中的作用。结果共获得19种细胞类型，与PBMC scRNA-seq的检测结果一致，在COVID-19尸检标本中，MACROH2A1在单核细胞和巨噬细胞中的表达量高于对照组。综上所述，MACROH2A1在循环免疫细胞和COVID-19患者肺组织中表达上调，提示MACROH2A1可能通过单核细胞和巨噬细胞的功能参与了COVID-19肺炎的发病机制。
Fig.4 snRNA-seq显示fatal COVID-19肺单核细胞和巨噬细胞中MACROH2A1的表达增强
5、MACROH2A1对Toll样受体7配体和IFN-gamma的反应性增加
基于上述研究结果，为了进一步研究刺激先天免疫系统以应对病毒感染，是否诱导了MACROH2A1，研究者通过PMA刺激人单核细胞系THP-1细胞，诱导巨噬细胞分化，添加toll样受体（TLR）配体和干扰素（IFN-gamma）进行刺激。结果显示，IFN-gamma显示出更强的诱导作用。说明，COVID-19感染后，MACROH2A1可能是通过TLR信号通路或IFN-gamma刺激在肺部或循环血液中被诱导，以应对病毒感染。
Fig.5 MACROH2A1对Toll样受体7配体和IFN-gamma的反应性增加
6、MACROH2A1对Toll样受体7配体和IFN-gamma的反应性增加
最后，为了整合这些血清EVs蛋白质组学、PBMC scRNA-seq，snRNA-seq数据的总体趋势，使用KeyMolnet进行分子网络分析。在MACROH2A1上游分子网络中，group 2和3中的EVs蛋白更多的富集到雌激素信号通路；group2、3与group 1相比，PBMC scRNA-seq单个核细胞主要富集到雌激素信号通路。此外，在MACROH2A1下游的分子网络种，血清EVs蛋白质组学中检测的蛋白，富集到“p160类固醇受体共激活因子（SRC）信号通路”和“STAT的转录调控”。这些结果显示了一个与所有三种组学分析相同的通路，表明在血清EVs蛋白质组学中，MACROH2A1在单核细胞中的功能得到了一定程度的重复。
Fig.6 MACROH2A1对Toll样受体7配体和IFN-gamma.的反应性增加
主要结论
本研究首次证明，EVs中的MACROH2A1是难治性COVID-19感染的潜在候选生物标志物，并且MACROH2A1可能通过单核细胞系和对SARS-CoV-2的先天免疫应答，介导了严重COVID-19的发病。此外，还可以考虑靶向MACROH2A1的药物开发。
参考文献
Kawasaki, Takahiro et al.“Next-generation proteomics of serum extracellular vesicles combined with single-cell RNA sequencing identifies MACROH2A1 associated with refractory COVID-19.” Inflammation and regeneration vol. 42,1 53. 30 Nov. 2022, doi:10.1186/s41232-022-00243-5
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