㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）：
1、概念：根据被分离蛋白质的（ ），利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。
2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
3、具体过程：
A. 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。
B. （1） 混合物上柱；
（2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；
（3） 的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。
（4） 不同的蛋白质分子完全分开；
（5） 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来， 的蛋白质还在行进中。
㈡ 缓冲溶液：
1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或 不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用：能够抵制（ ）的对溶液的（ ）的影响，维持PH基本不变。
3、缓冲溶液的配制
通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。
3．电泳
电泳是指 。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是 和 ，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。
4．蛋白质的提取和分离
蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。
5．样品处理
血液由 和 组成，其中红细胞最多。红细胞具有
的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质 ，其作用是
，血红蛋白有 个肽链组成，包括 ，其中每条肽链环绕一个 ，磁基团可携带 。血红蛋白因含有 呈现红色。
红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。
血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
分离血红蛋白溶液 将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:
第1层（最上层）：（ ）甲苯层
第2层（中上层）：（ ）的沉淀层，（ ）色薄层固体
第3层（中下层）：（ ）的水溶液层，（ ）的液体
第4层（最下层）：其它杂质（ ）的沉淀层
透析 取1mL的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的 中，透析12h。透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的 。
6．凝胶色谱操作
第一步要制作 ，第二步要 ，因为 ，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有 存在。因为气泡会 ，降低分离效果。第三步是
。
2）凝胶色谱柱填料的处理
（1）凝胶的选择：（ ）。
（2）方法：
配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（ ）中充分溶胀后，配成（ ）。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
1 固定：将色谱柱处置固定在支架上
②装填：将（ ）一次性的缓慢倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。
③洗涤平衡
装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（ ）12小时。
3）样品加入与洗脱
（1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口
（2）加透析样品
①调整缓冲液面：与凝胶面平齐
②滴加透析样品：用（ ）将1ml（ ）的样品加到色谱柱的（ ）
③样品渗入凝胶床：（ ）
④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱
⑤收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集
4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 。
五、操作提示
1、红细胞的洗涤： 、 与 十分重要。 过少，无法除去血浆蛋白； 过高和 过长会使 等一同沉淀，达不到分离效果。
2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入其中的
用 加热，加速膨胀。
3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低 。
4、蛋白质的分离：如果红色区带 地移动，说明色谱柱制作成功。
例：用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ D ）
A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快
C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快
例：(2008·山东高考)科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。
(1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的 、大小及形状不同，在电场中的 不同而实现分离。
1、凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是 ( )
A、改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B、吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度
C、将酶或纽胞固定在凝胶中 D、与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度
2、下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是 ( )
A、层析柱高 B、层析柱的直径 C、缓冲溶液 D、样品的分布
3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是 ( )
A、蛋白质分子所带的电荷 B、蛋白质分子的形状
C、蛋白质分子的相对分子质量 D、缓冲溶液的pH
4、为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场索取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是
A、要在采血容器中预先加人抗凝血剂柠檬酸钠 B、取血回来后，马上进行高速长时问离心
C、将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌 D、重复洗涤直到上清液呈红色为止
5、下面说法不正确的是 ( )
A、在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变
B、缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中
：用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ D ）
A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快
C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快
例：(2008·山东高考)科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。
(1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的 、大小及形状不同，在电场中的 不同而实现分离。
1、凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是 ( )
A、改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B、吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度
C、将酶或纽胞固定在凝胶中 D、与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度
2、下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是 ( )
A、层析柱高 B、层析柱的直径 C、缓冲溶液 D、样品的分布
3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是 ( )
A、蛋白质分子所带的电荷 B、蛋白质分子的形状
C、蛋白质分子的相对分子质量 D、缓冲溶液的pH
4、为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场索取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是
A、要在采血容器中预先加人抗凝血剂柠檬酸钠 B、取血回来后，马上进行高速长时问离心
C、将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌 D、重复洗涤直到上清液呈红色为止
5、下面说法不正确的是 ( )
A、在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变
B、缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成
C、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
D、透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内
6、蛋白质的提取和分离分为哪几步 ( )
A、样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
B、样品处理、凝胶色谱操作、纯化
C、样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D、样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
7、洗涤红细胞时，离心所采用的方法是
A、低速长时间离心 B、低速短时间离心 C、高速长时间离心 D、高速短时间离心
8、凝胶色谱法分离蛋白质中使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶(Sephadex G一75)，其中G、75的含义为 ( )
A、G表示凝胶的使用量，75表示加25 g水
B、G表示凝胶的交联程度，75表示需加热到75℃
C、G表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示每克凝胶膨胀时吸水7、5g
D、G表示凝胶的膨胀体积,75表示每克凝胶膨胀时体积可达75cm3
二、非选择题
9、下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(图I)和洗脱(图Ⅱ)示意图，请据图回答下列问题。
(1)在加样示意图中，正确的加样顺序是 。
(2)用吸管加样时，应注意正确操作，分别是① 。②贴着管壁加样、③ 。(3)等样品 。时，才加入缓冲液，待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 mL收集一管，连续收集。
10、PCR技术可扩增DNA分子，电泳技术是将待测样品放在光滑的凝胶薄膜上，并加上直流电场，可利用分子带电荷不同分离和分析氨基酸和多核苷酸片段等有机物。这两项技术综合应用于现代刑侦，可以获得最可靠的证据。如图是一次寻找嫌犯的测试结果：图申是把遗迹中含有21个氨基酸的多肽进行水解，将氨基酸混合物进行电泳的结果；图乙是通过提取罪犯B遗迹DNA和四位嫌犯的DNA进行扩增，并采用特定限制酶处理后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱。
(1)在同一电场下，由于蛋白质或DNA的 以及 、 不同而产生不同的迁移方向或速度，从而实现样品的分离。
(2)在电泳过程中，带电分子会向着 的电极移动。
(3)由图甲得知，多肽由 种氨基酸组成；由图乙可知B最可能的对象是 。
9.(1)④→①→②→③ (2)不要破坏凝胶面 使吸管管口沿管壁环绕移动
(3)完全进入凝胶层 红色的蛋白质 5
10.(1)带电性质 分子本身大小、形状 (2)与其所带电荷相反 (3)7 F2
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