空间组学揭示肝脏巨噬细胞微环境的进化保守性与差异
Highlights
健康和肥胖小鼠和人肝脏的空间组学单细胞图谱
经流式细胞术和荧光显微镜验证
LAM在正常和脂肪肝中的位置不同
进化保守的BMP9/10-ALK1轴对KC的发生至关重要
In Brief
通过将单细胞和核测序与 RNA 和蛋白质的空间图谱相结合，这个庞大的健康和肥胖人类和小鼠肝脏空间蛋白质组图谱提供了识别和定位所有肝细胞的方法，并提供了对肝髓系细胞的见解，包括识别可靠的表面标志物用于肝巨噬细胞的分离和定位，健康和脂肪肝中脂质相关巨噬细胞的表征，Kupffer 细胞发育的关键调控轴的测定，以及7个物种（包括鸡和斑马鱼）的 Kupffer 细胞保守核心基因表达特征的鉴定。
SUMMARY
肝脏是人体最大的实体器官，但其特征仍然不完整。在这里，我们提出了一个健康和肥胖的人类和小鼠肝脏的空间蛋白质组图谱，该图集结合了单细胞 CITEseq、单核测序、空间转录组学和空间蛋白质组学。通过整合这些多组数据集，我们提供了经过验证的策略来可靠地区分和定位所有肝细胞，包括胆管中的脂质相关巨噬细胞 (LAM) 群。然后，我们将这个图谱在七个物种中进行比对，揭示真正的Kupffer细胞和 LAM 的保守程序。我们还揭示了这些巨噬细胞各自的空间分辨细胞生态位和驱动其独特转录组特性的微环境回路。我们证明 LAM 是由局部脂质暴露诱导的，导致它们在小鼠和人类肝脏的脂肪变性区域中被诱导，而Kupffer细胞的发育关键取决于它们通过进化上保守的 ALK1-BMP9/10 轴与肝星状细胞的相互作用。
INTRODUCTION
单细胞转录组学的巨大进步使人们能够更好地了解跨物种不同器官的细胞组成。然而，我们仍然缺乏关于这些细胞如何在其独特的微环境生态位中组织的信息。此外，决定了组织中单个细胞的身份的特定的细胞间相互作用还需要被定义。虽然了解肝脏内肝细胞的空间组织，但非实质肝细胞的空间组织仍不清楚。小鼠肝脏就是这种情况，但人类肝脏更是如此，因为大多数肝细胞的鉴定和精确定位是未知的。此外，尚未研究转录组和蛋白质组之间的联系，导致缺乏可靠的表面标志物来通过流式细胞术和共聚焦显微镜识别这些细胞。在这里，我们使用蛋白质组学技术，包括通过测序对转录体和表位进行细胞索引(cite-seq)和空间方法来确定所有细胞及其在健康和肥胖小鼠和人类肝脏中的特定位置，以识别小鼠和人类健康和肥胖肝脏中的所有细胞及其特定位置。通过这样做，我们制定了识别和进一步研究肝细胞的策略。为了证明这种方法的有用性，我们确定了驱动不同肝巨噬细胞表型的进化保守和空间受限信号。
RESULTS
小鼠肝脏蛋白质组图谱
使用小鼠肝脏，我们比较了使用通过离体或体内酶消化分离的细胞的单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 与单核 RNA 测序 (snRNA-seq)（图 S1A-S1C）。我们没有观察到两种消化方法之间基因/细胞数量的任何差异（图 S1D 和 S1E），但 snRNA-seq 通常产生较少数量的基因/细胞（图 S1D 和S1F）。这并没有阻止在 snRNA-seq 数据集中识别出不同的细胞类型，因为 scRNA-seq 和snRNA-seq 在每个群体中都识别出高表达的基因。然而，scRNA-seq 中的表达通常更高（图 S1F）。
(A-C) UMAPs 显示细胞类型的注释和每种细胞类型的比例，作为使用(A) 离体消化分离的 UMAP 中总细胞的百分比； 13,144 个细胞，(B) 体内消化； 24,014 个细胞和 (C) 细胞核； 8,583 个核。
(D) 每种分离方法后带注释的 mac、B 细胞、肝细胞、内皮细胞和基质细胞群中基因/细胞的平均数量。
(E) 相关图显示当肝脏在体外与体内消化方案消化时在 mac 群体中捕获的基因。
(F) 相关图显示当使用体内消化方案分离细胞或分离细胞核时在mac、内皮细胞和肝细胞群中捕获的基因。
为了研究单细胞分辨率下的 mRNA 和蛋白质表达，我们使用了 CITE-seq，蛋白质和 mRNA 谱都被考虑用于聚类。对差异表达的基因和蛋白质（DEG/DEP；图S2A 和 S2B；表 S1）的分析确定了 17 种细胞类型（图 1B），它们在每种分离方法中都有不同的表现（图 S2C）。在 CITE-seq 分析中添加抗体可以识别所有细胞的表面标记，包括 Kupffer 细胞(KC) 的 VSIG4 和 FOLR2，而不会影响转录组数据的质量（图 2D）。该分析确定了 KC 的一个亚群。
肝髓细胞亚群的不同空间方向
为了定位识别出的细胞，我们使用 Visium 进行了空间转录组学分析。为此，我们从两个不同的方向切开肝脏，以描绘肝组织和包膜的轮廓（图 1C 和 S2K）。我们沿着空间轨迹对每个 Visium 点进行排序，并根据已知的肝细胞分区标记对门静脉、门静脉周围、中间和中央静脉区域进行注释，并使用共聚焦显微镜确认此注释（图 S2M）。通过使用参考 sc/snRNA-seq 数据，我们随后将每个点解卷积为其组成细胞类型，并研究了细胞丰度如何随分区而变化（图1F、1G 和 S2N）。虽然 KC 位置是分区的，但我们没有在 KC 的基因表达谱中发现强烈的分区模式。我们进一步鉴定了所有区域的 B 细胞、T 细胞、内皮细胞 (EC) 和基质细胞 (SC)，而在门静脉 (PV) 中发现了常规树突细胞 (cDC)，其在中央静脉中少量存在(图 1F、1G 和 S2N)。
为了在单细胞分辨率下验证这些位置，我们接下来试图确定也可以通过共聚焦显微镜工作的最佳细胞特异性表面标记。为了同时筛选多种抗体以识别那些通过显微镜工作的抗体，我们进行了第二次Visium分析，并补充了100种寡偶联抗体，这些抗体是根据CITE-seq结果选择的(图1H)。然后，使用MICS技术和60-plex抗体组，在单细胞分辨率下验证被确定为在空间上起作用的抗体(图1I)。使用Xcr1、Clec9a (cDC1s)和Cd209a、Mgl2和Clec10a (cDC2s)的表达，我们证实cDC1s和cDC2s主要位于门静脉(图1J)。由于cDC2s与单核细胞来源的细胞有许多共同的基因(图S2A)，我们也检测了普通单核细胞/mac (Cd14、Adgre1、Axl、Mafb、Cx3cr1和C5ar1)和KC特异性基因(Cd5l和Vsig4)的表达，以进一步验证它们是真正的cDC2s(图1J)。在这些分析中，mRNA表达的点状性质与髓样细胞的树突形状相结合，使得难以确定细胞边界并得出这些cDC2s和macs是不同细胞的结论。为了验证这一点，我们因此开发了一种结合mRNA检测(RNAScope)和表面蛋白检测的方案。结合蛋白表面标记物检查cDC-或MAC-特异性mRNAs的表达证实了PV
cDC1、cDC2s和非KC macs的存在(图1K)。
总之，通过结合多种空间转录组学和蛋白质组学方法，我们定位了小鼠肝脏中的所有细胞，并鉴定了髓系细胞中的其他异质性，这些异质性在单独检查sc/sn-RNAseq数据集时没有显示出来。这突出了结合单细胞和空间蛋白质组学技术来研究细胞异质性的力量。
(A) 通过离体（5 只小鼠，15个样品）或体内（5 只小鼠，19 个样品）酶消化从健康的 C57B/l6 小鼠中分离肝细胞。或者，通过组织匀浆分离细胞核（4 只小鼠，12个样品）。活细胞/完整细胞核经过 FACS 纯化。对于细胞，分选总活细胞、活 CD45+、活 CD45+、活肝细胞或骨髓细胞（活 CD45+、CD3+、CD19+、B220+、NK1.1+）。 18 个样品（7 个离体，1 1 个体内）也用一组 107-161 个条形码标记的抗体染色，用于 CITE-seq 分析。将所有数据集汇集在一起，并在 QC 后使用 TotalVI 对 185,894 个细胞/细胞核进行聚类。 (B) sc/snRNA-seq 数据的UMAP。 (C) 来自 Visium 分析的组织和包膜图像，其中覆盖了簇。 (D) Visium 斑点 (左) 和细胞起源 (右) 的分区 UMAP。 (E) 映射到组织切片上的分区模式。 （F 和 G）来自 sc/snRNA-seq 的指示细胞特征映射到 Visium 分区数据。(H) Visium 高度多重蛋白质分析中的 mRNA 分区模式和 VSIG4-ADT 表达模式（左）和指定抗体的分区表达模式（右）。 (I) 指定蛋白质的MICS 分析。 (J) 指定基因和细胞类型的分子制图。 (K) 同一组织切片中的 mRNA (Xcr1、Flt3l、Mafb 和 Clec10a) 和蛋白质 (MHCII 和F4/80) 表达。比例尺，50 毫米。 PV，门静脉； CV，中央静脉。箭头表示特定的细胞类型，颜色对应于细胞类型/标记。图像代表 2-4 只小鼠。
髓系细胞的精细分析确定了肝巨噬细胞的三个亚群
为了更好地理解非kc mac细胞，我们在sc/snRNA-seq分析中放大了髓系细胞(CDC、KCs、单核细胞和单核细胞来源的细胞)，定义了11个群体(图2A-2C；表S2)。这包括KC、3组非KC MACs，以及在单核细胞和巡视单核细胞(MACs)之间的细胞，称为过渡性单核细胞。仔细检查非KC mac，发现群集6为腹膜mac(图2B)。其余人群之间的degs表明，cluster7很可能类似于包膜MACs，表达Cd207和CX3CR1，而cluster8类似于我们最近在脂肪肝中描述的GPNMB+SPP1+脂质相关巨噬细胞(LAMs)(图2A-2D)。通过CITEseq数据进一步验证上述分群。尽管分子制图证实了囊膜中存在Cd207+Mac，但它也在CV处发现了Cd207+Mac，这在PV中很少发现(图2E-2H和S3G-S3J)。因此，簇7由囊膜和CV CD207+MACs组成。这一发现进一步证明了用空间方法来确认细胞身份的必要性。分子图还发现，静脉和血管上的巨噬细胞表达CCR2和Chil3(图2G、2H、S3H和S3J)，类似于过渡单核细胞(群集11)。最后，在胆管周围发现大量表达MACs的GpNMB(图2G、2H、S3H、S3K和S3L)。由于GPNMB的表达是簇8特异性的(图2B)，并且这些细胞类似于LAM，我们将这些细胞命名为胆管LAM。
KCs和LAMs在稳态鼠肝中功能不同
接下来，我们试图调查KCs和LAM之间的差异。对与这些细胞的生物过程相关的GO术语的分析表明，KC可能在调节体液反应中发挥作用，而LAM与免疫反应的关系更广泛（图2I和2J）。与此一致，在100倍蛋白质显微镜数据中，我们注意到，存在的B细胞中有很大一部分与KC相互作用，而T细胞没有观察到这一点（图2K）。这表明这两个群体之间存在相互作用，可能与小鼠KCs高表达B细胞趋化因子Cxcl13有关（表S2）。为了评估LAMs与KC的炎症性质，我们采用FACS纯化细胞，并进行qPCR分析，以检测各种细胞因子的表达。为了实现LAM纯化，我们在消化组织之前去除了包膜。与GO分析相吻合，LAMs在稳态下比KCs表达更多Il1b（图2L）。然而，尽管如此，在体内TLR4刺激下，它们在促炎和抗炎细胞因子方面的反应不如KC（图2L），这可能表明LPS耐受性。这可能是因为它们位于PV处，因此暴露于肠道血液中，尽管这仍有待测试。综上所述，这突出了这些细胞的独特性质和功能；然而，需要进一步的研究来确定这些细胞的确切作用。
图2.健康小鼠肝脏胆管周围的巨噬细胞群
(A)从图1B分离的小鼠髓系细胞的UMAP(71,261个细胞/核)，并与TotalVI重新聚类。
(B和C)细胞类型间的TOP DEGS(B)和DEPS(C)。
(D)GPNMB和Cd207的表达。
(E)共聚焦显微镜下VSIG4和F4/80(左)(小鼠巨噬细胞标志物)或MHCII、CD11c和DAPI(右)的表达。由白色箭头标识的包膜MAC。比例尺，50毫米。
(F)肝被膜指示基因的分子图谱。
(G)共聚焦显微镜下VSIG4、F4/80、GLUL和DAPI(左)或F4/80或CCR2(右，插图)的表达。比例尺，100毫米。
(H)门脉三联体指示基因的分子图谱。PV，门静脉；CV，中央静脉；HA，肝动脉；BD，胆管。箭头表示特定的单元格类型，其中颜色对应于标记。图像代表2-4只老鼠。
(i和j)KCS(I)和胆管LAM(J)的Top Go术语。
(K)MICS分析显示VSIG4(红色)、CD19(黄色)和CD3E(洋红)表达的代表性图像(左)和每视野发现的有/无KC的B或T细胞的百分比(右)。数据来自2只小鼠的多个视野。*p<0.001 t检验。
(L)给29周龄小鼠腹腔注射LPS或PBS 3.5 mg/kg，2h后无包膜取肝。用流式细胞仪(FACS)纯化KCS和LAM，用qPCR检测IL1b、TNF、IL10和IL18的表达，并与b-actin进行比较。
巨噬细胞亚群存在于不同的空间生态位中
由于所有mac群在局部环境中都与CD45-关系密切，我们进一步分析了 CD45-细胞，识别 ECs 和 SCs 的多个子集以及区分它们的门控策略（图 3A-3C 和 S4A-S4C；表 S3）。 EC 可以进一步细分为 4 个不同的集群，对其位置的分析可以将它们识别为 CV EC（集群 10）、LSEC（聚类9）、PV内皮细胞（聚类11）和淋巴内皮细胞（LEC；聚类12）（图3D、3E、S4D和S4E）。由于Visium在PVs和CVs中都发现了成纤维细胞（图3D），并且之前的一份报告表明这些细胞中存在不同的亚群（Dobie et al.，2019），我们进一步放大了SCs，以更好地评估其异质性（图3F、3G、S4A–S4C和S4F；表S4）。这表明间皮细胞和成纤维细胞的亚群仅限于b（图3H和3I）。Myh11+血管平滑肌细胞（VSMC）位于肝动脉、PVs和包膜，CVs周围（图3F-3H、3J和S4G）和Mfap4+Svep1+Clic5-Reln-成纤维细胞为CV成纤维细胞（图3G、3H、3J和S4G）。最后，我们确定了位于胆管细胞周围的Clic5+Reln+成纤维细胞（cluster3）的一个子集，我们称之为胆管成纤维细胞（图3J和S4G）。综上所述，这些在空间上不同的ECs和SCs亚群的存在突出了不同mac群体所处的特定微环境的独特性。
图3.肝巨噬细胞群居于不同的微环境
(A) 小鼠CD45-的UMAP图。从图1B分离的细胞(83,410个细胞/核)，与TotalVI重新聚集。
(B和C)细胞类型间的TOP DEGS(B)和DEPS(C)
(D)将来自sc/snRNA-seq的指示细胞标志映射到Visium分带数据。
(E)中央静脉(左)和两个不同的门静脉三联体(中和右)的指示基因的分子制图。
(F)从图3A中的UMAP分离的小鼠基质细胞的UMAP(5430个细胞/核)，并与scVI重新聚集。
(G)识别的不同细胞类型之间的Top DEGs。
(H)在分区的Visium数据上识别间皮细胞(上)和血管平滑肌细胞(下)标志物。
(I和J)肝包膜(I)或中央静脉(J；左)和门脉三联征(J；右)所示基因的分子图。PV，门静脉；CV，中央静脉；HA，肝动脉；BD，胆管。箭头表示特定的单元格类型，其中颜色对应于标记。图像代表2-4只老鼠。另见图S4和表S3和S4。
健康人肝脏蛋白质基因组图谱
为了确定小鼠和人类肝脏之间mac亚群及其不同微环境生态位之间的保守性程度，我们接下来使用sc/snRNA-seq和CITE-seq在19例肝活检中生成了人类肝脏的蛋白质基因组图谱（图4A、4B、S6A和S6B；表S1和S5）。由于Visium能够可靠地定位小鼠肝细胞，我们用它在4次活检中定位人类肝细胞（图4C）。然而，发现脂肪变性>10%患者的可见斑点与健康样本分开聚集（脂肪变性<10%；图4D和4E）。因此，我们使用健康样本计算基线分带，然后将该轨迹转移到脂肪变性样本上（图4F和S6F）。这表明脂肪变性主要存在于表达中央静脉周围地带基因的区域，如CYP2E1。这与之前的临床研究相吻合，该研究表明中央静脉周围脂肪变性在非酒精性脂肪肝（NAFLD）患者中最常见，尤其是在早期疾病中。然而，由于这些中央静脉周围区域比健康对照组大，这也可能意味着脂肪变性的存在改变了带状肝细胞基因的表达，但这仍有待测试。值得注意的是，整体细胞分布不受脂肪变性的影响，尽管中性粒细胞、单核细胞和单核细胞衍生的细胞在与脂肪变性相关的脂肪变性患者中优先分布在中央静脉周围（图4G）。
KCs在进化上保守的转录组学和蛋白质组学特性
到目前为止，还没有真正的人类KC的有效标志物被描述。在解释准确定义人类KC的困难时，我们发现单核细胞和MACs在人类sc/snRNA-seq数据中形成了单一的连续体，阻止了对人类KC的简单定义(图4B)。值得注意的是，在NASH小鼠肝脏中也观察到从单核细胞到KCs的类似连续体(图S5J和S6J-S6N，表S8)。我们观察到长期驻留的表达Timd4的KC和最近招募的Timd4-单核细胞来源的KCs(moKCs；图S6J-S6N)。由于在人类肝脏中存在这样的连续体，表明在健康的人类肝脏中也可能有单核细胞对KC池的贡献，我们接下来放大髓系细胞来研究这一点，确定了10个簇(图4H、S60O和S6P；表S2)。为了定义KC，我们通过这些簇检测了小鼠Top25KC基因的表达，确定了簇10是真正的人类KC(图S6Q)。与老鼠不同的是，它们优先位于中央静脉区域(图S6R)。Cluster9也表达了许多这些基因，但缺乏TIMD4(图S6Q)，这表明这些细胞可能是最近招募的moKCs。肝脏中moKC的存在与在移植供体肝脏中发现宿主来源的MACs的报道是一致的，并提示KC群体可能是胚胎细胞和单核细胞来源的细胞的混合体。虽然在mRNA水平上不是这样，但在CITE-SEQ数据中，VSIG4被发现是最好的人类KC蛋白标记物，而FOLR2、CD163和CD169也被鉴定为这些细胞的有效标记物，用于冰冻切片和石蜡切片的流式细胞术和共聚焦显微镜观察(图4I和S6S-S6X)。人肝VSIG4蛋白和KC特异性CD5L mRNA和MICS 100-plex蛋白的共同染色分析也证实了KC的中带定位(图4J和S6U)。为了评估KC的特性在进化中是否进一步保守，我们对猕猴、猪、仓鼠、鸡和斑马鱼的肝脏进行了分析(图4K)。我们通过将保守的人-鼠KC特征基因映射到数据集来识别KC(图4K和S7A-S7C)。然后，我们检查了所确定的每个KC种群的主要特征(图S7D-S7H；表S9)。可能由于核心KC转录因子的保守表达(图S7I)，在不同物种之间的转录本之间观察到了强烈的重叠。然而，每个物种也含有一些独特的KC基因(图S7J；表S9)。VSIG4蛋白在猪和猕猴KC中的表达也是保守的(图S7K-S7M)。同样，我们也能够根据保守基因识别出大多数其他种类的肝细胞(图S7N和S7O)。CDC2是主要的例外，因为特定的cDC2标记基因并不是在所有物种中都是保守的(图S70O)。
图 4. 跨物种鉴定真正的Kupffer细胞
[if !supportLists](A) [endif]从肝活检中分离出细胞/细胞核
(B) sc/snRNA-seq数据的UMAP。
(C) 4例患者活检标本的Visium数据的UMAP。
(D)根据脂肪变性百分比分割视野点。
(E)健康和脂肪变性肝组织，HE染色识别脂肪变性区。
(F) Visium数据的分区(上)与分区模式映射到肝脏组织(下)。
(G)从sc/snRNA-seq映射到Visium条带轨迹上的细胞标签，健康(上)，脂肪变性(下)。
(H)从图4B中分离出40,821个髓系细胞，与TotalVI再次聚集。
(I) VSIG4蛋白表达(上)和CD5L mRNA表达(下)。
(J) VSIG4、F4/80、FOLRB、GLUL联合Cd5l/ Cd5l在小鼠(左)和人(H25;右)肝脏。
(K) 从健康的猕猴、猪、鸡、仓鼠和斑马鱼中分离出肝脏，使用人鼠KC 特征基因识别KC。
LAM（脂质相关巨噬细胞） 在脂肪肝中的位置发生了改变
除了KC，我们还在人类髓系细胞中发现了不同的MAC簇（图4H）。为了更好地理解这些簇的性质，我们用共焦显微镜检查了人类肝脏中CD68+VSIG4-MAC的具体位置（图S8A）。这确定了CD68+VSIG4-MAC位于肝包膜内，靠近中央静脉和PVs以及胆管（BDs）（图5A-5C和S8A）。在健康猕猴肝脏的PVs和CVs以及BDs处也观察到类似的群体（图S7M）。对scRNA-seq数据的检查以及与小鼠特征的比较确定了未成熟和成熟LAM，未成熟LAM表达一些单核细胞基因（图4H、5D、S8B和S8C）。尽管最近被认为是纤维化人类肝脏特有的，我们在所有使用scRNA-seq分析的患者中都发现了LAMs，但脂肪变性>10%的肝脏中LAMs的比例有增加的趋势（图S8D），这与小鼠NAFLD中LAMs的数量增加一致（图S6J–S6N）。与健康小鼠一样，Visium在非脂肪变性肝脏的门脉区识别出人类LAM。然而，在脂肪变性的人类肝脏中，LAMs主要位于脂肪变性区域的中央静脉周围（图5E），这表明单核细胞被招募到健康和肥胖肝脏的不同位置，然后在那里分化为LAMs。激光共聚焦显微镜和分子图进一步验证了LAMs位置的改变（图5F-5H）。然而，这项分析没有发现任何包膜MAC，这表明这些细胞可能在我们的UMAP中缺失，可能是因为活检时有少量包膜组织。表达IGSF21的Mac1群体在组织中的数量非常少（图5G和5H）。这与它们和moKC相似的转录组学特征相结合，可能表明它们是在小鼠中观察到的moKC前体，但这需要进一步研究。以LAMs为重点，在小鼠NAFLD模型中也观察到它们在脂肪变性人类肝脏中位置的变化。在这里，在门静脉、门静脉周围和中间区域发现了LAM（图5I、S8E和S8F），符合这些区域脂肪变性的存在，并与我们之前的报告一致。标准饮食（SD）和WD喂养的小鼠LAMs的差异表达基因比较发现，在WD喂养的小鼠中，LAMs具有更成熟的表型，下调了一些单核细胞基因的表达，并增加了原型mac标记物的表达，这与人类肝脏中存在未成熟和成熟LAMs一致（图5J）。与更成熟的表型相匹配，WD衍生的LAM与SD LAM相比也表达较低水平的Il1b、Tnf和Il10（图5K）。虽然需要进一步研究来评估这些细胞在NAFLD中的确切功能，但这可能进一步表明LAMs具有保护作用，而不是致病作用。
图5.在健康肝脏的胆管中发现LAM，但在肥胖肝脏的脂肪变性区域中发现LAM
[if !supportLists](A) [endif]用共聚焦显微镜观察健康人肝(H14)被膜上的标记物的表达。比例尺，20毫米。箭头表示包膜Mac。
(B和C)共聚焦显微镜下显示门脉三联征标志物表达的代表性图像。
(D)使用小鼠胆管LAM基因签名和签名查找算法识别的人胆管LAM。
(E)来自scRNA-seq的人类LAM签名被映射到Visium分带数据上，健康(紫色)，脂肪变性(黄色)。
(F)共聚焦显微镜下所示标记物的表达。右边插图。比例尺，150毫米。插入比例尺，75毫米。
(G和H)指示基因在健康(G)和脂肪变性(H)人肝脏中的表达。右边插图。图像代表每种情况下有2名患者。
(I)用西方饮食(WD)或标准饮食(SD)喂养小鼠36周，诱发NAFLD，并进行微量分析。分析来自SD条件下的1个肝脏切片和WD条件下的3个肝脏切片。分区方式和H&E染色(左)和LAM和KC位置(右)。
(J)显示SD(紫色)和WD(黄色)喂养小鼠(共24+36周)LAM之间DEG的热图。
(K)从饲喂SD或WD 24周的小鼠肝脏中提取LAMs(在消化前去除包膜)，提取rna，并用qpcr检测与b-actin相关的基因表达。
CD45-肝细胞在确定巨噬细胞定位中的潜在作用
鉴于KCs在健康小鼠和人类肝脏中的定位改变，以及LAM在小鼠和人类健康肝脏和脂肪变性肝脏中的定位变化，我们接下来试图调查这些环境下Mac细胞的不同之处。人类肝脏中的CD45-细胞鉴定出与在健康小鼠肝脏中观察到的相似(亚)群体的内皮细胞、干细胞和肝细胞(图6A和6B；表S3)。在确定的CD45-的定位方面没有发现显著差异可以解释与小鼠相比位置改变的KC细胞(图6C和6D)。考虑到这一点，我们接下来利用NicheNet来检测KCs和CD45-只存在于人类体内的能够调节KC位置的细胞。该分析鉴定了LSECs表达的CCL23和CCL14，肝细胞表达的CCL16与人KCs而不是小鼠KCs表达的CCR1结合(图6E)。关键的是，这些配体优先位于中央静脉周围(图6F)，因此代表了关于KC在人类肝脏中位置潜在调控的进一步研究的有趣目标。我们下一步的目标是研究CD45-细胞对LAM在健康肝脏和脂肪变性肝脏中的位置的调节。鉴于在我们的sc/ snRNA-seq分析中脂肪变性的人类样本数量较少，以及患者之间的差异，我们转向小鼠NASH模型来研究这一点。放大sc(图6G;表S10)，我们发现wd喂养的小鼠中成纤维细胞增加。成纤维细胞和造血干细胞在基因表达谱上有相当大的重叠，这表明造血干细胞和成纤维细胞之间可能存在分化轨迹，尽管这一点仍有待体内验证。我们还注意到一个成纤维细胞亚群表达CCL2，CCR2的已知配体，它在NAFLD期间被招募到肝脏的单核细胞上表达，以及CD44和Vcam1，两个参与单核细胞招募和粘附的基因。两种成纤维细胞群均在门脉周围脂肪变性区域富集(图6I)，其中我们也观察到LAM的富集(图5I)。我们还发现CCL2和CD44在人成纤维细胞中高表达(表S3)，有可能招募胆管LAM。综上所述，这表明成纤维细胞可能在LAM的招募过程中发挥重要作用。
图 6. 巨噬细胞微环境细胞可能调节健康肝脏和脂肪肝中的巨噬细胞位置
(A)人CD45-的UMAP。从图4B中分离出细胞(15,481个细胞/核)，并与scVI重新聚集。
(B)识别的细胞类型之间的top DEGs。
(C)来自sc/snRNA-seq的标示细胞签名映射到Visium分带数据上，健康(上)，脂肪变性(下)。
(D)分子图定位不同的CD45-细胞。
(E)Circos图显示NicheNet预测KCs和LSEC、HSCs和肝细胞之间的配体-受体对(左)，UMAP显示指示的趋化因子在人肝中正常表达(右)，CCR1/CCR1在人和鼠NAFLD肝中正常表达(下图)。
(F)健康和脂肪变性的人类肝脏中指定基因的区带。
(G)从图S5J分离的小鼠NAFLD(SD和WD)基质细胞(4025个细胞/核)的UMAP(左)，并与scVI重新聚集(左)以及SD和WD喂养的小鼠中每种细胞类型的比例(右)。
(H)细胞类型之间的top DEGs。
(I) 给小鼠喂食西方饮食（WD）或标准饮食（SD）36周以诱导NAFLD，并进行Visium分析。
跨物种的差异NicheNet分析揭示了ALK1-BMP9/10轴在KC发生中的关键作用
在确定了Mac微环境细胞在调节Mac亚群位置中的潜在作用后，我们接下来试图确定这些细胞在调节Mac表型中的参与。为了评估保守的细胞-细胞相互作用在推动Mac跨物种异质性中的作用，我们对不同的肝脏MAC和CD45-进行了差异NicheNet分析。这揭示了LAM的很少的特定配体-受体对(图S8G；数据未显示)，暗示可能是局部因素，如代谢物，而不是独特的细胞-细胞相互作用，可能驱动LAM表型。事实上，这与LAM样细胞在包括肥胖脂肪组织、脑、肺和心脏在内的多个组织中的存在是一致的。与此相一致，用乙酰化低密度脂蛋白培养的骨髓单核细胞表达LAM相关基因(图7A)，表明脂质在诱导LAM表型中起主导作用。相反，对于KCs，我们发现多个配体受体对在人和鼠之间是保守的(图7B和S8G)。其中，激活素受体样激酶(ALK1)-骨形态发生蛋白(BMP)9/10通路在KCs(ALK1；由Acvr11编码)和星状细胞(BMP)9/10(分别由Gdf2/Bmp10编码)之间在七个物种间被发现是保守的，并被预测可以控制大量保守的KC基因的表达(图7B、7C和S8H)。
为了验证这个轴在KCs中的作用，我们培育了Fcgr1-Cre*Acvrl1fl/fl小鼠，从CD64表达的MACs中特异性地消除了ALK1。这导致VSIG4+KCs几乎完全丧失(图8D-8F)，表明进化上保守的ALK1信号对KC至关重要。为了确定KC的维持是否需要ALK1，我们培育了Clec4f-Cre*Acvrl1fl/fl小鼠，只从分化的KC中剔除了ALK1。这揭示了与在Fcgr1-Cre小鼠中观察到的相对相似的表型，这表明ALK1也是维持KC所必需的(图S8I)。为了直接测试KC发育过程中对ALK1的需求，我们产生了BM嵌合体，CD45.1 Clec4f-DTR小鼠在受到肝脏屏蔽的情况下接受照射，以避免任何辐射损伤。然后用CD45.2Acvrl1fl/fl或Fcgr1CrexAcvrl1fl/fl
BM重组这些小鼠。4周后，给小鼠一次腹腔注射。注射DT以耗尽KC，并在7天或13天后确定KC群体内的嵌合体(图7G)。我们观察到，在第7天，KO BM来源的细胞在KC池中几乎完全被WT BM来源的细胞击败。这在单核细胞中没有观察到，但在VSIG4-MACs证明ALK1对于早期KC的发展是至关重要的(图7H)。
最后，虽然NicheNet预测来自星状细胞的BMP9/10将通过ALK1发出信号，诱导KC的发育和维持，这一预测与我们之前的NicheNet分析一致，但最近的另一项研究表明，转化生长因子(TGF)b信号将对KC很重要。这一预测是基于Smad4信号做出的，Smad4信号是TGF-b受体和ALK1诱导的信号的共同下游效应因子。由于TGF-b也被发现参与了含有ALK1-TGF-b受体的信号复合体，因此我们研究了TGF-b信号对KCs是否重要。为此，我们利用了ALK1-Fc陷阱或TGF-bII型受体(TGFbRII)-Fc陷阱以及适当的同型对照。ALK1-Fc选择性地隔离BMP9/10，而TGFbRII-Fc选择性地干扰TGFb1/TGF-b3受体结合。清除Clec4f-DTR小鼠的KC，同时用受体Fc陷阱或同型对照进行治疗，7天后检查KC的发育情况(图7I)。与嵌合体研究一致，ALK1-Fc可显著抑制KC的发展，但阻断TGFb信号转导对VSIG4-Mac仅有很小的影响(图7J)。总之，这证实了NicheNet的预测，并表明进化上保守的ALK1-BMP9/10轴对KC的发育和维持至关重要。
图7.ALK1-BMP9/10轴调节KC发育
(A)小鼠骨髓单核细胞在CSF1和特定浓度的人ac-LDL存在下培养，然后用qPCR分析指示基因的表达。数据来源于2个实验。用Bonferroni进行单因素方差分析后检验，与0 ng/mL进行比较。
(B)NicheNet Circos图突出显示人类和小鼠的KCs和指定的微环境细胞之间保守的配体-受体对和诱导的靶基因。
(C)显示ALK1(Acvrl1)在人髓系细胞(左)和GDF2/BMP10在CD45-中表达的特征图 (右)。
(D)取Fcgr1-CrexAcvrl1fl/fl小鼠、Acvrl1fl/fl或Acvrl1+/+对照小鼠的肝脏，用VSIG4检测KCs(左)和定量(右)。
(E)在Fcgr1-CrexAcvrl1fl/fl或Acvrlfl/fl对照小鼠中，Mac群体所指示的KC标记的表达。数据来源于3个独立实验，每组n=9。t检验。
(F)共聚焦显微镜观察Fcgr1-CrexAcvrl1fl/fl、Acvrl1fl/fl或Acvrl1+/+对照组小鼠肝脏中指示标志的表达。比例尺，50毫米。图像代表每组2只老鼠。
(G)嵌合体实验装置示意图。
(H)Clec4f-Dtr小鼠在DT部分照射后7天或13天，接受Acvrlfl/fl或Fcgr1-CrexAcvrlfl/fl
Bm治疗4周后，血中Ly6chi单核细胞的嵌合率恢复到正常水平。数据来源于2个独立实验，每组10-12只小鼠。
(I)FC捕捉器实验装置示意图。
(J)显示VSIG4和CLEC2总MACs表达的代表性FACS图。
DISCUSSION
要生成任何人体组织的实用细胞图谱，并解开对该组织中细胞的特性至关重要的细胞-细胞回路，需要四条关键信息：(1)所有存在的细胞的清单，(2)组织内不同细胞的位置，以识别相邻细胞之间的相互作用，(3)允许任何预测的细胞-细胞相互作用受到干扰的人和动物模型之间的比对，以及(4)识别可靠的基于抗体的小组，以有效地筛查不同的患者和/或转基因动物。在这里，通过整合单细胞、空间转录和蛋白质组学数据，我们为肝脏提供了这4条信息，并揭示了控制肝脏巨噬细胞发育的进化保守的微环境回路。
解开所有肝细胞的空间定位，我们在健康的小鼠、人和猕猴的肝脏中发现了胆管周围的LAM。然而，当脂肪变性出现时，LAM优先招募到肝脏的脂肪变性区域。这种空间信息至少部分地推翻了LAM身份是由纤维化的SCs特异性诱导的假设。相反，我们的数据表明LAM是由局部脂质暴露引起的。我们还提供了七个物种的肝脏图谱的比对。这揭示了稳态KCs的保守和独特的转录程序，并揭示了KCs和构成其生态位的细胞之间的空间受限和保守的配体-受体对。我们强调在试图理解疾病如何扰乱细胞之前首先表征健康组织的必要性，我们确定DLL-Noch相互作用是稳态LSECs和KCs之间进化上保守的相互作用，因此并不是肝细胞癌或纤维化所独有的，正如所提出的。同样，我们发现FOLR2的表达不是肿瘤相关的肝MACs所特有的，而是在健康的小鼠和人的肝脏中由KCs表达。最后，我们从广泛的寡核苷酸结合抗体面板出发，应用蛋白质组学进行单细胞和空间图谱分析。这一点至关重要，因为转录图谱并不总是与通过流式细胞仪或显微镜检测蛋白质的能力相对应。
通过广泛的筛选，我们确定了分离和定位肝脏MACs及其各自细胞的最佳表面标志物。这既可以在单细胞水平上验证空间位置，也可以有效地筛选KCs丢失的转基因小鼠模型。使用我们定义的面板对Fcgr1CrexAcvrl1fl/fl小鼠的特征很容易地证明了ALK1-BMP9/10轴在KC发育中的关键作用，强调了Mac-基质细胞-细胞间的相互作用比生长因子的交换更进一步。展望未来，将这些相对便宜的抗体面板应用于大的患者队列或多个转基因小鼠模型，应该能够有效地识别任何扰乱肝脏稳态的扰动。
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