与前两代相比，三代测序最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。实现了对每一条DNA分子的单独测序。目前三代测序技术已应用于基因组测序、甲基化研究和突变鉴定等多个研究领域。其中，英国牛津纳米孔公司所开发的纳米孔(Nanopore)测序技术便是三代测序中的中流砥柱。

Nanopore 测 序 原 理

Nanopore测序是基于纳米孔电信号测序技术，核心就是利用一个纳米孔，孔内共价结合有分子接头，将纳米孔蛋白固定在电阻膜上后，再利用动力蛋白牵引核酸穿过纳米孔。当单个碱基通过纳米尺度的通道时，会引起通道电学性质的变化。理论上，4种不同碱基（A、C、G、T）化学性质的差异会导致其穿过纳米孔时引起的电学参数变化不同，对这些变化进行检测可得到相应碱基的类型，进而实现测序。

Nanopore 测序中发挥着重要作用的几种物质

图片来源:Oxford Nanopore Technologies官网

Reader——跨膜蛋白，可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白纳米孔。经过人为基因工程修饰后，得到Nanopore测序所需的Reader蛋白。

Membrane——多聚物薄膜，Reader蛋白会被嵌入到高电阻率的由人工合成的多聚物膜中，膜两侧是离子溶液，在两侧加不同的电位，离子就会在孔中流动，形成电流。

Motor——马达蛋白，在Nanopore文库构建时，需要在接头上连接一种马达蛋白，用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。

Tether——用于锚定DNA或RNA链，防止其在溶液中飘动，并使其进入纳米孔中。

Nanopore 测 序 过 程

解螺旋，将双链DNA解开成单链；DNA单链分子通过一个孔道蛋白，孔道中有个充当转换器的蛋白分子；DNA单分子停留在孔道中，有一些离子通过带来电流变化，而不同的碱基带来的电流变化不同；转化器蛋白分子感受5个碱基的电流变化；根据电流变化的频谱，应用模式识别算法得到碱基序列。

主 要 优 势 

1 超长读长

在纳米孔测序中，读长长度不受限于测序设备，用户可以通过所使用的文库制备实验方案来控制片段长度。目前报到处DNA片段长度最高记录为>2 Mb，直接RNA测序读长最长为26kb。

2 直接测序

纳米孔技术基于电子学原理，允许直接测序原始DNA和RNA。不需要通过DNA拷贝、进行链合成或使用亚硝酸盐进行转化，这不仅节省了时间和成本，还意味着碱基修饰的信息（例如5mC，pseudouridine，m6A）会被完整的保留，并且包含在测序运行产生的原始信号信息中，随时进行分析。由于纳米孔技术支持无需PCR的直接测序，也就没有了扩增偏好性，并且文库制备工作流程也更简单。

3 实时测序

纳米孔技术提供的是动态、实时的测序，支持在几分钟内就获得病原体鉴定等时间关键型应用的检测结果。测序时，DNA快速通过纳米孔。DNA片段通过纳米孔的速率已从推出时的每秒35个碱基提升到了现在每秒450个碱基。每一个在阵列上完成的读长，在数秒后就可以用来开始数据分析，用户可以在测序早期了解样本的质量和状态，也可以在获得足够的数据后停止测序。

4 按需要测序

在纳米孔测序中，用户可以自行掌握测序时间、地点、以及需要使用的芯片数量。例如，可以单次使用的最小型的测序芯片Flongle适合快速质量检测、小型基因组实验和靶向测序。

5 启动费用低

传统的高通量测序价格昂贵，启动需要数十万至百万人民币。而纳米孔测序目前启动套装只需要17271元，包括MinION测序仪，两张测序芯片，一盒建库试剂盒，一盒清洗试剂盒。两张芯片最多可以测序60G数据。

6 灵活、可扩展

所有Oxford Nanopore测序设备使用同样的核心技术，用户可以轻松根据应用测试实验以及扩大或缩小规模。从最小型的Flongle和掌上MinION,到桌面型的GridION和PromethION。所有设备都可用于进行按需测序实验。

胡润 | 文案