单细胞转录组的研究表明，哺乳动物乳腺上皮组织中主要包含基底细胞（basal cell）、分泌型腔细胞（secretory luminal cells，L-Sec）、激素受体细胞（hormone-responsive luminal，L-HR）等3种细胞类型。不同细胞的表型受到细胞表观学编码的调控，而单细胞转录组的研究无法对此进行深入探讨。近来有研究者使用单细胞ATAC测序（scATAC-seq）对组织中细胞的染色质开放性区域和调控元件进行研究，能够从表观层面揭示细胞分化与表型形成的深层原因。2020年10月，来自加利福尼亚大学生物化学系的Kai Kessenbrock团队在Cell Reports上发表了题为“Integrated Single-Cell Transcriptomics and Chromatin Accessibility Analysis Reveals Regulators of Mammary Epithelial Cell Identity”的研究论文，结合单细胞RNA测序（scRAN-seq）与单细胞ATAC测序的手段，对乳腺上皮细胞的异质性以及腔细胞内部的表观调控关系进行了深入研究。
研究者选择后初情期小鼠的乳腺上皮细胞进行了scATAC-seq分析，经过降维和聚类分析，鉴定到基底细胞、L-Sec、L-HR、基质细胞等不同的细胞类型（图1）。其中在L-Sec内部鉴定到两个不同的细胞簇群（C2、C3），C3在基底细胞的标志基因Krt14上具有较强的开放性，可能是一种具有向基底细胞与腔细胞双向分化功能的祖细胞。
为了对这一结果进行验证，研究者又对乳腺上皮细胞进行了scRNA-seq分析，同样鉴定到基底细胞、L-Sec、L-HR三种细胞类型（图2）。在L-Sec内部，scRNA-seq分析鉴定到两种细胞类型，其中一种高表达泌乳相关基因，研究者称为泌乳型祖细胞；另一种高表达一般腔祖细胞相关基因，研究者称为腔祖细胞（图2B）。使用泌乳型祖细胞的标志基因（CD61/Itgb3）进行细胞流式实验，发现CD61+细胞高表达泌乳功能相关基因，而CD61-细胞高表达腔祖细胞功能相关基因。这些结果说明，在L-Sec内部确实存在泌乳型祖细胞与腔祖细胞两种细胞亚型。
接下来研究者使用拟时间分析方法研究了不同细胞亚型之间的转化关系，结果显示，腔祖细胞与泌乳型祖细胞之间存在连续的演化关系（图3）。使用文献中报道的祖细胞相关基因与滤泡分化细胞相关基因对不同细胞亚型进行基因表达的评分分析，发现腔祖细胞具有较高的祖细胞基因分数与较低的滤泡分化细胞分数（图3B）；而泌乳型祖细胞具有较低的祖细胞分数与较高的滤泡分化细胞分数（图3C）。这些结果说明腔祖细胞能够逐渐转化为泌乳型祖细胞。在scATAC-seq鉴定到的L-Sec亚型中进行拟时间分析，同样发现腔祖细胞与泌乳型祖细胞之间存在连续的演化关系（图S3）。对随拟时间分化路径而动态变化的开放性区域进行鉴定，发现在特定时间下高活性的开放性区域。对这些开放区域的转录因子基序进行分析，发现随分化路径而表现出活性增强和减弱的转录因子，如Smad2（图3D）和GATA1（图3E）。Smad家族蛋白主要对转化生长因子信号进行调控，而GATA主要参与成熟腔细胞分化过程的调节。这些结果说明不同的转录因子分别在细胞分化过程中的不同阶段发挥十分重要的作用。
最后研究者对scATAC-seq数据与scRNA-seq数据进行了整合分析，结果显示两组数据在细胞类型鉴定上具有较高的一致性（图4）。对细胞类型特异性开放的转录因子进行分析，发现了在基底细胞中具有特异性高开放性的TP63、SMAD3，在L-Sec中具有特异性高开放性的ELF1，以及在L-HR中具有特异性高开放性的FOXA1，这些转录因子调控的下游基因在相应的细胞类型中也表现出特异性的高表达现象（图4C）。采用共开放性分析对增强子-靶基因调控关系进行研究，发现在泌乳型祖细胞中，Folr1与其附近的增强子区域之间存在明显的共开放性（图4D），同时scRNA-seq数据显示Folr1在泌乳型祖细胞中表达出更高的表达（图4E）。这些结果说明，Folr1与其附近增强子之间的调控关系在泌乳型祖细胞的分化过程中起到十分重要的作用。
总的来看，文章通过对乳腺上皮细胞进行scATAC-seq与scRNA-seq分析，对上皮细胞异质性进行了研究，发现在L-Sec内部存在泌乳型祖细胞与腔祖细胞两种不同的细胞亚型，并分析了两种亚型间的转化关系。通过转录因子分析发现了不同细胞亚型特异性的转录因子，最后通过共开放性分析鉴定到泌乳型祖细胞特异性增强子调控关系。这些结果为之后乳腺上皮细胞的分化过程研究提供了重要参考。
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