前面已经介绍了多个甲基化泛癌早筛的产品（国内泛癌早筛产品梳理之甲基化靶向测序篇）以及甲基化marker的筛选（甲基化标志物筛选：Grail VS 燃石），但是泛癌早筛产品基于NGS测序平台，一次需要检测成千上万个甲基化区域，成本较高，产品单价5000元以上。
现在NMPA已经批准了不少的单癌早筛产品（除了诺辉的肠癌早筛证书，其它严格意义上都是辅助诊断证书），主要集中在肠癌，肝癌两个癌种上，单癌早筛产品基于qPCR平台，只检测某几个甲基化区域的甲基化水平，成本较低，产品单价大多在500-2000元之间，甚至更低，是大众可以消费起的产品。
单癌早筛产品是如何开发的呢？单癌早筛产品开发的第一步也是甲基化标志物的筛选，筛选的步骤同泛癌早筛产品类似，也是需要根据NGS测序数据进行筛选，筛选十几个或者几十个具有最强信号的癌症标志物，后续设计引物时可能有些区域难以设计，因此初步可以多筛选一些。
首先介绍一下qPCR甲基化检测的原理，挑选到甲基化标志物（一般筛选高甲基化标志物，即癌症患者中甲基化水平更高的标志物），首先假设该序列所有CpG位点都发生了甲基化，将目标区域转换为都发生甲基化的序列（即所有CpG位点的C保持不变，其他的C都转化为T），然后根据转化之后的序列设计引物。qPCR会设置一个荧光强度阈值（图中Threthod虚线），扩增曲线与Threthod线的交点就是该标志物在该样本中的Ct（Cycle threthod）值，代表扩增了多少次可以达到目标的荧光强度。
很明显，CT值与起始模版的浓度有关，浓度越高，需要达到目标荧光强度所需的循环数越少，CT值也就越低。
癌症患者甲基化标志物的甲基化程度更高，与设计的引物完全匹配的起始模版浓度更高，CT值会比非癌样本更低。
image.png
经过qPCR，就得到多个甲基化位点的CT值（qPCR检测时一般会加入内参，后续可以减去内参的CT值，得到ΔCT值，以去除批次效应），后续就可以筛选最有效的甲基化标志物的组合，可以看到现已获批的大多数甲基化产品（甲基化检测试剂盒最新概览）检测基因数目都在5个以下。
获得目标的甲基化标志物CT值后，可以使用机器学习模型建模（一般使用逻辑回归模型取sigmod函数），也可以每个标志物设置一个阈值（首先判断每一个标志物的阴性或者阳性，所有标志物中只要有一个阳性就可以判别此样本为阳，全部阴性时才为阴性）。
理论上，每一个癌种的单癌早筛产品都可以按照此思路进行开发，但是为什么现在获批的主要产品集中在肠癌，肝癌上呢？这就是qPCR的缺点了，单癌早筛产品要求极少的甲基化标志物（一般少于5个）实现较优的性能（至少比传统的肿瘤标志物要好）。能够满足这个条件的癌种目前看主要是肠癌和肝癌，另外也有少数的宫颈癌，食管癌，胃癌，膀胱癌产品获批，还有众多的癌种未有覆盖。
NGS平台一次可以检测成千上万个靶点，而且相比qPCR平台，NGS平台可以实现单碱基水平的分辨率，可以得到单个CpG位点的甲基化水平。相比qPCR平台在单癌种鉴别上肯定会有更好的效果，唯一的限制因素就是成本，只要应用上NGS平台，产品单价一般5000元起步，大众哪消费的起。
因此基于NGS测序，不少公司都搞了泛癌早筛产品，一次可以检测多个癌种，这样就摊低了检测成本。但根据现有的数据，国内还没有一个能拿出手的大规模前瞻性验证的数据能证实泛癌早筛产品的性能，还没有一个能让大众乐于掏钱的泛癌早筛产品。
未来路任重而道远。
网友评论