一、COIP原理：
CoIP（Co-Immunoprecipitation)即免疫共沉淀，以抗体和抗原之间的专一性互作为基础，用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效技术；属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体及能与抗体结合的proteinA/G珠就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（即pull-down），达到富集该蛋白复合物的目的；进而通过质谱的方式鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员或通过WB验证已知蛋白是否与预测蛋白结合。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。
二、实验流程
大致实验流程：
裂解细胞：获得总蛋白液
细胞裂解液与抗体孵育：蛋白-抗体复合物
磁珠与蛋白-抗体复合物孵育：蛋白-抗体-磁珠复合物
洗涤：去掉非特异结合的蛋白
洗脱：将蛋白-抗体复合物重磁珠上分离出来
WB或质谱鉴定
三、实验注意事项
抗体选择：用于COIP实验的抗体必须是IP级别的抗体，所以选购抗体时一定要看清楚该抗体能否用于IP实验。如下图为ABCAM中某个抗体的应用范围及使用量说明，选购时需注意。
涉及吸取珠子的操作时，为了避免损伤 beads，使用大口径或经过剪短后枪头进行加样。
注意加入蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂；避免蛋白降解影响结果。
细胞裂解要用温和的裂解试剂，不能破坏蛋白质间的相互作用，采用NP40 或Triton X-100等非离子去垢剂，不能用高浓度的去垢剂(0.2%SDS)。
当然并不是所有蛋白都有对应的IP级抗体，当没法找到合适的抗体是可以通过表达融合了Flag标签的蛋白，利用Flag标签做免疫沉淀。
四、操作步骤
1. 预冷PBS洗涤细胞3次，最后一次吸干PBS;
2. 每个含细胞的1.5ml EP管中加入预冷的等体积的IP细胞裂解缓冲液700ul(预先加入5ul的蛋白酶抑制剂)，混合器上4℃裂解30min；
3. 16000g，4℃离心15min，取80ul上清作为Input，另分别取300ul及300ul上清于新的1.5ml EP管中，作为IP样及IgG样本；
4. IP样本中加入2~5ug目的抗体（具体根据抗体说明而定），IgG样本中加入2ul IgG抗体4℃旋转孵育过夜；
5. IP及IgG样品分别加入40ul IP05，4℃垂直混匀器摇动孵育过夜；（IP05需预先用400ul PBST洗涤3遍）
6. 4℃,4000rpm 离心1min,除去上清;
7. 用400ul PBST洗涤5次，每次4℃摇动洗涤3min，4℃,4000rpm 离心 1min,除去上清;
8. 加入80ulIP裂解液及Loading buffer混匀沸水煮10min。
PS：
如期生物于表观领域深耕多年，具有丰富的经验；欢迎交流合作，当然单纯技术咨询交流也是可以的哈：
网友评论