引物设计原则
一、Tm值
sense primer和anti-senseprimerTm温差最好不超过2度。
二、GC% GC含量
对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。三、Degeneracy 多义性
当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3’末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。四、3’ End Stability 3 末端稳定性
3’端避免以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3’避免出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配；引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3’末端。如果引物3’稳定性强，有可能在即使5’末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带（secondary bands） 。而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于3’末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。五、GC Clamp GC钳
引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5’末端。这一段有较强稳定性的5’末端称为GC钳。它保证引物与模板的稳定结合。选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。
六、Secondary Structures 二级结构
二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率，形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。
七、Hairpin 发卡结构
发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应。
八、Dimer 二聚
引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构。它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物，二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，如果配对区域在3’末端问题会更为严重，3’末端配对很容易引起引物二聚体扩增。
九、False Priming 错配
如果引物可以结合除目的位点外的其他区域，扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布（smear）。3’末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对，在使用引物设计软件时，您可以分别设定确认为错配的3’末端或引物全长形成连续碱基配对的数量。
十、结果参数查看
引物报告参数说明
Rating：引物得分（满分100：得分越高引物设计的越合理）
Seq No：引物序列在DNA序列上的起点位置
Length：序列长度
Tm[ °C]：DNA解链温度
GC%：GC百分含量
▷G[kcals/mol]：反映引物和模板结合强弱的程度
A ****ctivity[****μ****g/OD]：引物的吸光度值
Degeneracy：多义性
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