恶性肿瘤是一种由多基因参与的复杂疾病，其发生、发展到转移的过程，伴随着一连串复杂的生物学机制。虽然精准医学已经大大提高了肿瘤综合防治水平，但仍然会遇到诸多问题，如获益群体差异、耐药性发生、不良反应等。而多组学维度下的研究，能够层层深入地揭示问题根源，找到真正的阿喀琉斯之踵。
单细胞测序是揭示肿瘤研究中克隆异质性研究的重要技术，而蛋白则是生命活动的直接执行者，其功能往往受到翻译后修饰的调控。目前已发现的蛋白翻译后修饰类型有300多种，其中磷酸化是最广泛的一种蛋白翻译后修饰，几乎参与了所有生命活动，是生命活动的调控开关。RPPA反相蛋白微阵列则是一种可以同时检测蛋白翻译后修饰和蛋白表达变化的技术，可在多达1000+微量样本中平行比对300+已知激酶、细胞信号蛋白及药物靶点，对于发现异常的激酶或者信号通路、锁定潜在治疗靶点有着无可比拟的优势。
本文解读了如何将“单细胞测序+RPPA功能蛋白组学”进行巧妙结合，以抗PD-1免疫治疗联合靶向治疗为策略，用小鼠黑色素瘤模型开展深度机理研究的案例。非因生物作为目前国内唯一可提供RPPA靶向蛋白检测的服务商，可提供此联合测试方案。
研究背景
黑色素瘤作为致死率极高的恶性肿瘤，治疗方法极其有限，靶向BRAF通过抑制RAF-MAPK信号轴进而抑制黑色素瘤的分化增殖；而近几年兴起的免疫检查点疗法，通过调节T细胞应答介导对肿瘤细胞的杀伤，持续性增强抗肿瘤活性，但是由于脱靶效应及强烈的细胞毒性，临床至今仍无法将两者有机地结合起来。前期实验确定了曲美替尼和色瑞替尼联合治疗对BRAF-突变型和BRAF-野生型黑色素瘤细胞模型、以及BRAF-野生型黑色素瘤小鼠模型的有效性，而免疫疗法也是BRAF-野生型黑色素瘤的主要治疗手段。因此，作者推测按照抗PD-1免疫治疗（IT）联合BRAF靶向治疗（TT）的顺序给药策略，可实现更持久的抗肿瘤效应。
研究思路
研究结果
1、 IT->TT顺序治疗会引起最大程度的免疫细胞表型改变
黑色素瘤的治疗效果主要依赖于免疫细胞和髓系细胞的浸润，单细胞测序结果表明IT->TT顺序治疗引起了最大程度的单核细胞、粒细胞、T细胞、成纤维细胞和内皮细胞的增值（图1A、1B）。同时流式细胞术的结果也表明，该治疗方式会明显增加T细胞的浸润、降低Treg和髓源抑制细胞(MDSC)的侵袭（图1C、1D）。
2、IT->TT顺序治疗会积累活化的CD8+ T细胞并改变髓系细胞的分布
使用阻断抗体耗尽T细胞后，对小鼠注射肿瘤细胞，肿瘤形成后即进行不同方式的治疗，以观察IT->TT顺序治疗的持续效果是否与T细胞活性相关，结果表明CD8+ T细胞的驻留对于肿瘤抑制起到重要作用（图2A、2B）。经IT->TT顺序治疗的样本中，相关免疫细胞与T细胞、B细胞的数量与占比均为最高（图2C），CD8+ T细胞主要为记忆T细胞和效应T细胞，并表达多种活化和抑制性标记物（图2D）。
对髓系细胞亚群进行分析发现，不同治疗方式的浸润细胞种类有着显著差异。IT->TT顺序治疗的样本富集了更多的粒细胞和单核/DC细胞，而非巨噬细胞（图3A）；且由于DC细胞中MHC-1表达的增加激活了CD8+ T细胞的应答（图3B）。通过单细胞异质性分析发现，不同的治疗方式均以独特的方式改变其转录异质性（图3C）。IT->TT治疗方式显著增加了TYRP1和黑色素瘤谱系标志物SOX10的表达（图3D），可增强DC细胞对肿瘤抗原的识别，进而促进抗肿瘤免疫应答。
3、RPPA功能蛋白组学结果表明IT->TT顺序治疗抑制NRAS突变黑色素瘤中耐药特征的出现
为研究不同免疫靶向联合后所带来的机制，作者同时采用RPPA靶向蛋白组学技术对肿瘤样本的信号通路进行分析，发现IgG->TT与IT->TT顺序治疗的小鼠肿瘤细胞信号通路中存在显著差异（图4A），主要集中在细胞凋亡和信号适应的相关通路（图4B、4C）。值得注意的是，IgG->TT顺序治疗的肿瘤具有与治疗逃逸相关的信号特征，包括磷酸化RAF、AKT、MAPK和多受体酪氨酸激酶（包括c-MET、IGF1R、HER1和HER2）水平升高（图4B）。IgG->TT顺序治疗后的细胞对曲美替尼表现出抗性，但对色瑞替尼没有抗性，治疗后AKT或MET信号通路几乎没有变化（图4D）。使用ERK i（已知可限制NRAS突变黑色素瘤细胞中的MEK i耐药性）处理耐药细胞，增加了MAPK信号在免疫逃逸中的作用抗原表达，尽管程度低于未使用药物的SW1细胞（图4E）。这些结果共同表明，靶向治疗逃逸伴随着免疫识别的降低，进一步支持免疫系统在介导持续靶向治疗反应中的作用。
研究结论
在本研究中，作者创新性地将“单细胞测序+RPPA功能蛋白组学检测”巧妙结合，探究不同治疗顺序对黑色素瘤抗肿瘤治疗的持续性和有效性，验证了在SW1-NRAS突变和SM1-BRAF突变小鼠黑色素瘤模型中，anti-PD1联合色瑞替尼-曲美替尼(IT->TT)比任何一种单药策略都更为效，在SW1-NRAS突变模型中anti-PD1联合达拉非尼-曲美替尼也表现出同样的效果。
单细胞测序揭示了不同治疗条件下免疫细胞亚群的差异，在探索起关键作用的细胞亚群中起到重要作用，且差异基因的分析对通路探究有着指向性作用。
基于RPPA功能蛋白组学的药物靶点通路分析，尤其是磷酸化蛋白的分析，对于理解IT->TT治疗方式显著改善抗肿瘤免疫反应的机制有着重要的作用。该技术使得作者可以在同一轮测试中同时观察到大量样本、300+蛋白（包括磷酸化蛋白）的表达差异，可直接观察到通路上各个关键蛋白的变化和磷酸化水平的调节情况，也可直接分析是否有代偿性机制等。RPPA在系统性、大规模的信号转导及药物靶点研究中，因其超高灵敏度、高重复性和指向性，有着其他高通量蛋白组学技术无可比拟的优势。
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