关键词

plasmonic metasurface, biosensor, SARS-CoV-2, Omicron, point-of-care testing

文献信息

"Affinity Exploration of SARS-CoV‑2 RBD Variants to mAb-Functionalized Plasmonic Metasurfaces for Label-Free Immunoassay Boosting"

ACS Nano 2023, 17, 3383−3393

https://doi.org/10.1021/acsnano.2c08153

通讯：厦门大学朱锦峰

摘要

单克隆抗体(mAb)功能化的等离子体超表面(PMs)是一种很有前景的生物光子传感器，可用于生物分子相互作用分析和各种生物标志物(如SARS-CoV-2)变体的免疫分析。以往的PM生物传感技术存在亲和检出率低、对各种SARS-CoV-2变体缺乏充分的免疫分析研究等问题。在此，我们开发了一种基于单抗的无标签PM传感器的高效亲和力测试方法，并展示了它们与12种此图受体结合域(RBD)变体的结合特性。除了研究等离子体近场对表面生物分子传感的影响外，我们还全面报道了12种SARS-CoV-2 RBD变体与单抗抗体功能化PM之间分子动力学的 Langmuir 结合平衡，这在无标签免疫传感中起着至关重要的作用。高亲和 mAbs 可与高灵敏度的传播等离子体模式结合，以提高SARS-CoV-2变体的检测。为了更好地了解PM的分子动力学，我们开发了一种超灵敏的SARS-CoV-2变体Omicron生物传感器。实验结果表明，P < 0.0001与其他病毒引起的呼吸道疾病有很大的区别，检测限比商用胶体金免疫法小2个数量级。我们的研究展示了低成本晶圆级 PM 的无标签生物传感，这将提供生物分子相互作用的基本信息，并促进未来对新出现的SARS-CoV-2变体的高精度即时检测。

研究背景

2019年冠状病毒病T大流行(COVID-19)伴随着各种病毒变种的不断出现。迄今为止，世界卫生组织已经确定了8个关注变量(VOIs)和5个关注变量(VOCs)，以评估其对公共卫生的风险，已经有超过5.55亿例COVID-19病例和630万例死亡病例尽管在疫苗接种、预防和治疗方面已经做出了艰苦的努力，但最近的Omicron变种反映了高传播和免疫逃逸，这对低收入和中等收入国家构成了巨大的挑战，因为它们缺乏医疗保健因此，开发快速可靠的检测工具对于控制当前和未来的SARS-CoV-2变种疫情仍然至关重要。SARS-CoV-2的持续传播导致了全球老年患者的住院率和死亡率升高。目前，基于抗原和抗体免疫分析的多种设备已被研究用于SARS-CoV-2等病毒的检测，其中基于高通量纳米结构的等离子体超表面(PM)生物传感器由于其无标签和实时检测功能备受关注。然而，以往的PM生物传感存在动态传感亲和检测率较低、对各种新出现的SARS-CoV-2变体缺乏充分的免疫分析研究等问题。分子动力学方面的研究不足，阻碍了PMs在COVID-19大流行期间广泛而强大的传感应用因此，对分子与PM生物传感器的结合进行全面的亲和性研究，对SARS-CoV-2变体的超灵敏检测仍有必要。

众所周知，spike (S)蛋白中的SARS-CoV-2受体结合域(RBD)负责与宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2 (ACE2)结合，并介导病毒进入细胞(见图1A)。这一特性表明，RBD变体应该有几个保守的表位遗传自野生型RBD。由于RBD是宿主抗体反应的主要靶点，因此遗传特征可用于诱导广泛结合抗体31，这可促进SARS-CoV-2变体的诊断或疫苗接种的发展。32,33除了保守的表位外，与WT RBD相比，RBD变体通常带有一些取代和残基缺失。具体来说，目前Omicron的RBD在其基因组中具有异常高的突变数量，34,35，这也给其免疫测定带来了新的挑战。在本工作中，我们制备了一系列抗RBD单克隆抗体，并利用棱镜表面等离子体共振(SPR)研究了它们与SARSCoV-2变体的结合特性。将具有多种等离子体模式的PMs用不同的单克隆抗体进行功能化，系统地研究了其对各种SARS-CoV-2 RBD变体的分子亲和力特征。我们通过a给出了12种SARS-CoV-2 RBD变体与mAb功能化PM之间的Langmuir结合平衡的全面物理图像。该系列实验在等离子体免疫传感中起着关键作用。我们的研究表明，高亲和力单抗与等离子体模式的高表面敏感性可以显著促进SARS-CoV-2变体的无标签检测。它们进一步用于人类唾液和血清样本的RBD测试，并证明其检测限(LOD)远低于通过横向流动试验(cg - LFA)试剂盒进行的商业胶体金免疫检测。我们的研究表明，利用等离子体元元传感器进行生物分子相互作用分析，对遏制SARS-CoV-2变异的传播具有重要意义。

Figure 1. Schematic diagram for detecting SARS-CoV-2 RBD variants by PMs with high-affinity mAbs. (A) Invasion of host cells throughbinding the ACE2 with the SARS-CoV-2 RBD, whose WT and five typical variants are denoted. (B) Capture of RBD by mAb-functionalizedPMs and optical sensing. (C) Indicative spectral shifts due to the bindings of 11-mercaptoundecanoic acid (MUA), mAb, and RBD,respectively. (D) SEM image of PM by a 45° oblique view.

结果与讨论

筛选SARS-CoV-2 RBD特异性单抗

为了制备SARS-CoV-2 RBD特异性单克隆抗体，我们采用人工重组WT RBD，安全可靠地模拟SARS-CoV-2抗原特征。如图S1所示，SDS-PAGE表明，重组RBD具有高纯度，分子量(MW)约为32 kDa。此外，所有血清样品均显示对重组RBD有良好的反应性。接下来，我们制备相应的特异性单克隆抗体，将其用作兔免疫序列的免疫原。根据前期工作，进行多参数流式细胞术单细胞分选对抗原特异性记忆B细胞进行染色和分离，如图S2所示。基于这些分类的RBD特异性B细胞，我们获得了10种抗体，ELISA在上清液中检测到兔IgG表达，见图S3。在10种抗体中，除NO和NS外，有8种抗体与山羊抗兔(GAR) IgG抗体结合，表现出明显的生物分子的活动。特别是，三种单克隆抗体(N2, N4和N7)表现出RBD特异性结合，而对不相关抗原流感血凝素(HA)无非特异性反应。因此，这3种单克隆抗体可作为特异性捕获RBD的候选抗体。

我们通过ELISA初步分析了N2、N4和N7的mAb/RBD结合特性，见图S4。明显的光学响应表明，这三种单克隆抗体都可以有效地结合到同一WT RBD上。这一评价被经典的基于棱镜的SPR免疫分析进一步定量证实，如图2B-D所示。SPR分析表明，WT RBD与3种单抗(N2、N4和N7)的结合均遵循典型的分子动力学过程，缔合率大(ka为1.52 ~ 2.24 × 10 M-1s-1)，解离率小(Ka为2.42 ~ 9.50 × 10-3 s-1)。根据这些参数，计算出它们的关联常数KA的值为分别为7.52 × 107 M-1、2.35 × 107 M-1、4.18 × 107 M-1。从分离过程来看，N2和N7与WT RBD的结合稳定性高于N4。这意味着N2和N7应该是开发高性能SARS-CoV-2 PM免疫传感器的最佳单抗候选抗体。

Figure 2. (A) Reactivity of isolated rabbit mAbs from transfected supernatant against GAR IgG antibody, RBD, and HA. (B−D) Bindingkinetic properties between WT RBD and N2, N4, and N7 mAbs by prism-based SPR.

等离子体模式对光学灵敏度的影响

PM生物传感器的结构结合纳米结构(图SS和S6)、光学测量和模拟进行了优化。它由垂直分离的金纳米孔和在硅衬底上具有正交晶格的纳米盘组成，如图1D和图S9。在正常光照下测量的反射光谱图3A显示了4个不同的共振下降，分别对应于4种特定的等离子体模，分别为M1, M2, M3和M4。通过一系列光学模拟和相应的场分布，进一步确认和分析了这些模式(图3A; 图S10)。由于周期元单元的瑞利异常，M2模属于一种晶格共振。该模式主要由超表面的周期性决定，假设对超单位结构变化不敏感，如图3B所示。模式M3表示离散金纳米盘的局部表面等离子体共振，其工作波长对元单位的缩放比M2敏感得多。模式M1和M4 (图3A) 归因于传播表面等离子体激元(SPR)。它们的共振波长一般可以用公式λ = P(EAua)1/2[(Au + a)(m2 + n2)]-1/2来计算，其中P，整数(m，n)， Au，分别表示PM的单位单元周期、互反向量的二维光栅阶数、金的介电常数和有效环境介电常数。M1和M4分别表示SPP模式的(1,1)和(1,0)阶。与M1相比，当纳米孔和纳米盘直径从~160 nm增加到~236 nm时，M4的共振波长红移(36.1 nm)更大。在四种等离子体模中，M4随着胞径的增大红移最大。

接下来，我们通过使用逐层组装方法测量表面折射率灵敏度(SRIS)来评估四种等离子体模的光学探测能力。每一组装层由正聚组成(丙烯胺盐酸盐)(PAH)和负聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS)。共振波长位移作为PAH/PSS双分子层数(N)的函数绘制在图3C中。观察到，所有等离子体模的波长位移随着Ng的增加逐渐增大并达到饱和值。M1 ~ M4的饱和位移值(Ns > 35)分别为~54.4 nm、~59.6 nm、~73.3 nm和~77.1 nm。这一排名与氧化铝保形沉积和体折射率灵敏度的测量结果一致(见图S11和S12)。具体而言，在最敏感的近场区域(NB≤5)，M4表示每PAH/PSS双分子层的最大共振位移约为4 nm，而M2的最小共振位移不超过4 nm2.5 nm /双分子层。M4和M2的表面传感性能与图3B中的模态分析一致。为了更详细地比较表面灵敏度，我们计算了四种等离子体模的共振波长位移二阶混合偏导数，即二阶SRIS。在图3D中，我们根据以下公式将其绘制为PAH/PSS厚度的函数:

式中，n、t分别为PAH/ PSS双分子层的折射率和厚度，m为敏感因子，la为倏逝电场的有效指数衰减长度;四种模式的m和la可以通过eq 1固定(见表S1)。图3D清楚地表明，M4模式在t从O到60 nm的PM近场区域具有最高的二阶SRIS。在SARS-CoV-2免疫检测最敏感的20 nm(黄色遮光区域)表面范围内，M1和M3的表面灵敏度相当，M2的二阶SRIS最低，M4的表面灵敏度最高。四种等离子体模的二阶SRIS结果与N2和N7单抗功能化PMs饱和检测WT RBD的结果一致，如图3E,F所示。所有的检测信号都被四参数logistic (4PL)回归公式很好地拟合，M4的灵敏度最高，ECso最小(见表S2和表S3)。采用M4的最佳等离子体模式检测兔血清样本中的WT RBD，如图3G所示。与双辛酸测定的标准浓度相比，N2或N7单抗修饰的PM生物传感器的最大变异系数(CV) <10%。PMs的良好传感性能初步显示了WT RBD检测在未来临床诊断中的潜力。由于SARS-CoV-2 RBD变体与WT RBD的分子结构和重量非常相似，M4与N2或N7单抗组合可能是PM检测各种SARS-CoV-2 RBD变体的有效候选模式。

Figure 3. (A) Measured and simulated reflectance spectra of PM, where the inset denotes the electric field distributions of M4 mode. (B)Measured reflectance spectra for PMs with the unit cell diameters of ∼160 nm, ∼196 nm, and ∼236 nm, respectively, where thecorresponding SEM images and wafer-scale PM photo are provided. (C) Experimental wavelength shift as a function of PAH/PSS bilayernumber, where the inset represents the amplified results from 0 to 5 bilayers. (D) Comparison of the second-order SRIS curves for fourplasmonic modes. Measured wavelength shift as a 4PL function of WT RBD concentration for PMs functionalized by (E) N2 and (F) N7mAbs. (G) WT RBD detection in rabbit serums by PMs functionalized with N2 and N7 mAbs. The inset denotes the CV values of detection.

mAb对RBD的亲和力

PMs上单克隆抗体与RBD变体的亲和性。为了验证筛选的单克隆抗体的交叉反应性，我们在WT RBD序列中引入相应的突变来表达重组RBD变体。根据图4A中的表征，12种VOC和VOI表现出非常接近的MWs的高纯度。接下来，我们通过基于棱镜的SPR系统分析了mAb/RBD的结合亲和力。从图4B可以看出，各种RBD变体的KA值均大于2.00 × 107 M-1。这表明，N2和N7单抗是捕获SARSCoV-2的各种RBD变体的合适广泛抗体候选，用于后续的PM免疫检测应用。值得注意的是，尽管RBD变体具有几乎相同的蛋白形态和分子量，但它们与特定种类的单抗具有不同的结合亲和力(即不同的Ka值)，这可能源于它们基因组上的突变。从图4B可以看出，Delta变体N2/RBD的KA值高于N7/RBD，而Omicron BA.1/BA.2处理N7的KA值更高与其他RBD变体的N7相比，RBD显著增大。其中，N7/Omicron BA.2 RBD的KA值高达56.81 × 107 M-1，具有较高的结合亲和力。在Omicron BA.1 RBD的动力学测量中，与N2单抗相比，N7单抗具有更高的结合率(k)和更低的解离率(ka)(见表S4和S5)。因此，在检测过程中，N7单抗应在快速孵育和缓慢解离中占主导地位。N7/Omicron BA.2的缔合速率比N2/Omicron BA.2的缔合速率低约1个数量级，而N7/Omicron BA.2的解离速率比N2/Omicron BA.2的缔合速率低约2个数量级(见表S4和表S5)。在RBD测试过程中，PM具有更快的缔合和较慢的解离特性，可以支持PM在流体刷新后具有较大的光学响应。

结合基于棱镜的SPR亲和分析，我们接下来评估了RBD变体与N2和N7单抗功能化pm的结合能力。如图4C所示，我们绘制了N2和N7 mab功能化pm的光学响应作为等离子体模式和100 ng/mL (3.125 nM)的各种RBD变体的函数。对于具有最高结合亲和力的N7/Omicron BA.2，应用的RBD浓度约为解离常数Kp (Kp = 1/KA)的两倍。这是利于图4C中显著的光学响应差异的最佳浓度。对于每种mAb/RBD结合，M4和M2模式分别具有最大和最小的光学响应。所有RBD变体的模式检测特征与图3E,F中WT RBD的测试相似。这进一步证明了M4对SARS-CoV-2变异检测的高传感性能。用N2和M4的波长偏移为3.0 nm，略微大于N7和M4的2.8 nm。相反，N7和M4的Omicron检测明显大于N2和M4。值得一提的是，N7和M4探测到的Omicron BA.1和BA.2的波长偏移最大5.5 nm和5.7 nm。这些结果与图4B所示的亲和性差异一致。生物物理学可以通过Langmuir结合平衡进一步解释如下:

其中Г为RBD变体的表面覆盖率，比值Г/ Гmax表示单抗在PM上捕获RBD变体的概率，CRBD表示RBD变体的浓度。根据图4B,C中的数据，我们比较了理论RBD覆盖率Г/Гmax和M4模式的实验波长漂移响应作为图4D中RBD变量的函数。在我们的免疫分析体系结构中，N2和N7单克隆抗体的形态和MWs非常接近，而RBD变体的形态和MWs几乎相同。由eq 2可知，CRBD和Kp具有相同的计量单位，当所有RBD变体的浓度均为3.125 nM时(与Kp的量级相当)，由Kp(或KA)决定的mAb/RBD结合亲和力成为影响每种RBD变体Г/Гmax的最关键因素。基于平衡理论，较高的RBD变体的结合亲和力对应于较高的PM表面覆盖率Г/ Гmax，从而导致较大的光学响应(等离子共振波长偏移)。根据上述图4C、D的结果，我们的生物传感平台可以克服快速ELISA的标记筛选方法和基于无标签棱镜的SPR分析缓慢的缺点，有望成为一种新的生物传感平台。

Figure 4. (A) SDS-PAGE and Western Blot results of purified SARS-CoV-2 RBD variants. (B) Binding affinities of N2 and N7 mAbs to 12SARS-CoV-2 RBD variants measured by the prism-based SPR. (C) Resonance wavelength shifts of 100 ng/mL RBD variants for N2 and N7mAb-functionalized PMs. (D) Theoretical RBD coverage ratio and M4 response (wavelength shift) as functions of SARS-CoV-2 variants, aslisted on the horizontal axis according to their KA values in ascending order. Here, the concentrations of all RBD variants are 100 ng/mL.

PM检测人唾液和血清中的Omicron BA.2 RBD

血清样本。在评估了等离子体模式和mAb/RBD的生物传感亲和性后，我们接下来将重点放在检测特异性的研究上。通常，感染SARS-CoV-2的患者的症状与其他一些呼吸道病毒(如甲型流感病毒(IAV)和其他冠状病毒)的症状非常相似。它们可能具有与SARS-CoV-2相似的表面蛋白成分，并由于非特异性吸附而干扰检测。为了排除这些影响，我们引入EBV的糖蛋白B (gB)， IAV的核衣壳蛋白(NP)和HA, SARS冠状病毒的RBD，中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒的RBD，如图SA所示。Omicron BA.2 RBD PM检测的M4共振波长偏移显著高于对照组。n7功能化PM生物传感器可以特异性和充分地识别Omicron BA.2。这些结果初步证实了PM生物传感技术在鉴别SARS-CoV-2变异方面的特异性和可行性，可用于进一步的临床应用。

鉴于鼻咽/口咽拭子和血清的SARS-CoV-2免疫检测，我们接下来重点研究唾液和血清样本中Omicron BA.2 RBD的PM检测。为了验证样品的RBD结合，我们进行了氮元素的能谱(EDS)映射和原子力显微镜(AFM)，如图S13和S14所示。这些特征证明了PMs上RBD的有效捕获。在样品测试之前，通过测量从10 pg/mL到10 ug/mL (PBS溶液)的浓度，得到RBD感测曲线，如图SB所示。采用4PL公式拟合共振波长位移作为RBD浓度的函数(见表S6)。49,50传感LOD为26.8 pg/mL，比现行CGILFA低2个数量级(见图S15)。根据4PL公式，RBD检测动态范围为0.18 ~ 54.85 ng/mL。在唾液和血清样本的检测中，PM检测结果与校准浓度吻合良好，如图5C所示，这表明我们的方法诊断COVID-19的可行性。更重要的是，由于RBD浓度低于5 ng/mL，因此CGI-LFA检测结果通常为阴性，而PM生物传感器具有更强的检测低至0.25 ng/mL的能力。与CGI-LFA检测相比，PM生物传感具有更高的敏感性，可有效防止新冠肺炎早期假阴性和误诊。因此，我们的研究提供了mAb/RBD在无标签PM生物传感器上的特异性和亲和性的物理学见解，实现了Omicron BA.2 RBD的高性能检测，也将促进未来针对新出现的SARS-CoV-2变体的抗体开发和应用。

Figure 5. (A) Specificity identification of RBD by PM biosensors for Omicron BA.2 from other viruses, including EBV, IAV, SARS andMERS, where “****” means the probability P < 0.0001 in statistical significance analysis. All the sample concentrations are 10 μg/mL. (B)M4 resonance wavelength shift as a function of RBD concentration for Omicron BA.2, where the detection threshold is set as 3 times ofstandard deviation (s.d.) for the signal from a blank, and the error bars take the s.d. of measuring 3 times for each concentration. (C) PMtesting of RBD in saliva and serum samples for Omicron BA.2 compared with commercial CGI-LFA, where the error bars take the s.d. ofmeasuring 5 times for each sample. The CGI-LFA is considered as positive after the appearance of a colored band with the strong (++) orweak (+) intensity in the test (T) line and as negative for a noncolored band (−).

研究结论

总之，我们利用PM生物传感器研究了抗rbd单克隆抗体对12种SARS-CoV-2变体的亲和力。经高亲和单克隆抗体功能化后，可作为SARS-CoV-2变体的检测试剂。通过全波模拟和表面分子测试实验，研究了生物传感器的等离子体效应和光学近场传感。更重要的是，我们提供特异生物物理分析4种等离子体模式和12种SARS-CoV-2 RBD变体，对PMs上抗体/抗原结合行为的生物物理学见解。制备的PM生物传感器对SARS-CoV-2 Omicron BA.2变体与其他呼吸道病毒表现出出色的区分，其检测限度远低于主流商业试剂盒，并在人类唾液和血清样本中表现出超灵敏的检测性能。因此，我们的工作阐明了在不进行实时检测的情况下，以经济有效的方式对SARS-CoV-2变体进行高效定量免疫分析。在不久的将来，人们可能会进一步探索PMs的分子结合动力学，这不仅有助于开发无标签生物传感器，用于快速筛选针对新出现的SARS-CoV-2变体的高亲和力单克隆抗体，而且还为开发其他带有机械或声学生物传感信号的无标签检测平台提供生物物理模型指导。