NGS技术未来的一大方向，就是在对碱基进行测序的同时，记录下检测到的碱基来自的位置，通常是二维坐标系上的位置，有时还包括z轴这第三个维度。2021年12月15日，Nature主刊的论文，介绍了slide-DNA-seq技术，该技术可同时对DNA和mRNA进行原位测序的技术，并用其来研究癌组织的异质性。
细胞和组织的分化，受到其内部DNA和RNA差异，以及由周围细胞组成的环境因素这两者的共同影响。对于肿瘤组织，其形成的原因，更是归因于细胞内的基因变异（例如单碱基突变，拷贝数变异，染色体级别的基因重组），以及肿瘤微环境。如能同时对肿瘤组织的表型，以及其不同位置的基因进行检测，就能量化地研究基因和环境的因素是如何影响肿瘤组织的生成的，并了解肿瘤组织的异质性和转移，复发和抗药性之间的关系。
之前的研究肿瘤异质性，要么是对不同阶段的肿瘤组织，进行高深度测序，根据突变频率的差异，来估算不同阶段肿瘤的演化；要么在晚期的肿瘤组织中，用激光切除一小块，对其进行测序。相比来说，新推出的slide-seq，可以在一个直径3毫米的视野内，以10微米的分辨率，对每不同位置的聚苯乙烯珠子，添加对应空间位置的条形码，标记空间位置，之后通过PCR扩增，实现DNA原位测序。在每个阵列中，包含2万到4万个柱子，每个珠子中，可以检测到的DNA序列，约为165-421个。
slide-dna-seq的实验流程
拿到slide dna-seq数据之后，标准的分析流程是怎样了？该研究给出了可以两种借鉴的套路，一是结合原位转录组数据，一是结合单细胞全基因组测序。在第一种套路下，对肿瘤组织的相邻切片，分别进行原位RNA测序，染色和免疫荧光检测和slide dna-seq。对得到的带有位置信息的DNA覆盖度数据，仿照空间转录组的模式，进行PCA降维，之后使用K-means聚类，将肿瘤组织分为几个子类，如下图所示的，该切片被分为了正常组织，以及两种不同的肿瘤子克隆。
slide dna-seq分析方法：数据降维和聚类
为了说明对肿瘤组织分为两个子类是有根据的，对不同类之间，不同位置上，染色体不同段之间的覆盖度，使用双边置换检验计算P值，在不考虑多重比较的时候，将不同位置的p值以热图的形式展现，如下图，可以看到分出的两个子克隆，在特定的染色体上的覆盖度，存在显著的差异，且出现差异的位置，和不同分类的边界一致。将全部染色体的覆盖度绘制为散点图，其中蓝色代表正常组织，红色和绿色代表两种肿瘤组织的亚克隆，将显著差异的部分区分开，可以看出其的确存在显著的差异。由于检测的是Kras诱导的肺肿瘤，因此其特有的6号染色体的扩增差异显著，而在其它区域的覆盖度则是正常的。
不同聚类的染色体覆盖的散点图和差异区域的p值在空间上的热图
在对相邻的组织切片，使用slide-RNA-seq进行原位RNA检测后，通过使用单细胞转录组的数据进行投影，同样可以将进行组织聚类，得到的结果，和slide dna-seq的数据是相似的。将不同亚克隆中，各个基因的表达量差异（横轴）和这种差异事虚假的可能性（纵轴），以火山图的方式展示（图f），可以找出不同亚克隆之间的差异基因，通过将这些基因的表达量以热图形式展示，可以看到在两个亚克隆之间，找出的差异基因在空间上是有显著差异的。
对相邻肿瘤切片，进行原位转录组测序，得出的聚类图，差异基因火山图
接下来，要回答的问题，是确定每个肿瘤克隆中的RNA的特征。对相邻的slide-dna-seq和slide-rna-seq，分别聚类后，绘制不同聚类的结果，以及肿瘤组织的癌细胞密度图。之后将不同亚群（横轴）及不同密度的癌细胞中，关键基因能解释多少差异以热图展示，可以发现两个亚克隆，存在着不同的进化路径。而不同位置的肿瘤组织中癌细胞密度的差异，也可以归因于LGALS3，这个在肿瘤抑制中发挥作用的基因，以及PROMI基因，其和肠道内平衡，再生和肿瘤生成有关。
另一种套路，是将原位转录组测序换成单细胞dna测序。由于在10微米的分辨率上，是存在多个细胞的，因此该套路的最初步骤，和前面描述的类似。对短序列进行比对后得到1兆区域内的覆盖度信息（平滑处理，去除实验带来的波动），PCA聚类后找出差异的区域。但区别在于，对单细胞DNA测序的数据，同样比对后计算不同区域的覆盖度，之后距离，再将使用单细胞DNA测序得到的聚类投影到slide dna-seq上。
使用slide dna-seq和单细胞WGS对肿瘤异质性进行多组学分析的套路
从图e和f可以看出，使用单细胞wgs和slide dna-seq，对相邻组织切片可以得出相近的结果，即都是chr8上，不同肿瘤组织间存在显著差异，这也可以从图g的平均覆盖度散点图中看出，蓝色代表的亚型，其在chr8上的覆盖深度更高，意味着其中的拷贝数更多。而从图c的染色切片和聚类结果的对比，可以看出两者有类似的空间模式。
总结dna-slide-seq技术，通过提供高分辨率，高敏感度的原位dna测序，该方法适合对具有异质性的肿瘤组织，结合原位转录组，进行多组学分析，可采用于最直接的基因组覆盖度的差异，以描述不同位置肿瘤的染色体拷贝数差异，是如何于差异位置的基因表达量差异相一致的。而结合单细胞全基因数据，则可以将相邻部分的数据整合，考察不同位置肿瘤组织中，癌细胞杂合缺失程度的变化。
未来，使用dna-slide-seq可以构建描述肿瘤组织随时间演化过程的数据库，或将该技术应用于临床诊断，通过判别肿瘤亚型，找出和生产率，转移及复发有关的亚型，并定位关键基因。该技术不仅仅适用于肿瘤组织，其实验的关键，即在扩增前，在组织原位加上标记序列，可用于空间宏基因组，或检测空间不同位置的甲基化或染色质开放性水平。
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