今天跟大家分享的是发表在ONCOIMMUNOLOGY（IF: 8.110）上的一篇文章，主要是对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在EGFR/ ALK阳性非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤免疫微环境中的作用进行探究。TKI在携带EGFR突变和ALK重排的非小细胞肺癌治疗过程中发挥关键作用。然而，TKI对肿瘤免疫微环境(TIM)的影响尚未完全阐明。因此，研究者们对TKI治疗前后EGFR/ ALK阳性的NSCLC样本进行RNA测序和全外显子测序，结合新抗原和突变负荷分析，使用xCell和单样本基因集富集分析(ssGSEA)评估肿瘤免疫细胞浸润与活性。此外，还基于基因加权相关网络分析识别与治疗和免疫应答相关的hub基因并在公共数据集合中进行验证。
综合分析表明酪氨酸激酶抑制剂(TKI)诱导EGFR/ ALK阳性非小细胞肺癌肿瘤免疫微环境重构
Comprehensive analyses reveal TKI induced remodeling of the tumor immune microenvironment in EGFR/ALK-positive non small-cell lung cancer
1.数据
本文数据包括来自于公共数据集的TCGA肺腺癌数据，GSE11969中34例EGFR突变肺癌样本的微阵列数据和自测的osimertinib（TKI靶向药物）治疗前、后样本的RNA表达数据。
2.TKI用药前后的EGFR突变和ALK重排患者的转录组改变
基于t检验分别识别EGFR突变和ALK重排的肺腺癌患者在TKI治疗和响应后发生差异表达的基因（FDR<0.05），其中1442个基因在治疗后的EGFR突变和ALK重排患者中同时表达上调，1425个基因同时表达下调（图1A-B）。GO富集分析表明，上调的差异基因与免疫应答显著相关，下调的差异基因主要与细胞粘附和连接等过程相关（图1C）。对只在EGFR突变或ALK重排的肺腺癌患者中发生差异表达的基因进行分析，发现与ALK重排患者相比，EGFR突变患者的差异基因被更多的富集到免疫和细胞周期相关通路（图1D-E）。此外，通过GSEA分析发现TKI显著调控EGFR突变或ALK重排患者的免疫和细胞周期相关通路（图1F-G）。综上所述，研究者认为TKI治疗可能改变EGFR突变或ALK重排中TKI应答者的肿瘤微环境。
图1. TKI用药后的EGFR突变和ALK重排患者的转录组改变
3.TKI治疗可重塑EGFR突变或ALK重排患者的肿瘤免疫微环境（TIM）
为了进一步验证TKI处理对TIM的影响，研究者基于xCell方法计算EGFR突变或ALK重排患者治疗前后免疫，微环境和和基质相关打分。TKI治疗后，不管是在EGFR突变还是ALK重排患者中，免疫打分、微环境打分和基质打分均显著升高(图2A-B)。此外，研究者还基于ssGSEA对TKI处理前后样本中16种细胞的浸润水平进行评估。其中， CD8 + T细胞、自然杀伤细胞(NK)等抗肿瘤活性细胞在TKI治疗后显著增加(图2C)。另外，多种免疫过程相关基因在TKI治疗后EGFR突变或ALK重排患者中发生表达上调（图2D）。然而，一些与抗原呈递相关的基因下调(如CALR、CANX和PDIA3，图2D)，这可能是在TKIs治疗后ALK重排应答者中T细胞浸润有限的原因。此外，研究者还发现在TKI治疗后的新抗原负荷和突变负荷减少（图2E-F），这可能导致ALK重排样本在TKI治疗期间抗原呈提递减弱并限制随后的T细胞抗肿瘤反应。
图2. TKI治疗可重塑EGFR突变或ALK重排患者的肿瘤免疫微环境
4.TKI治疗前后体细胞突变的改变
EGFR突变或ALK重排患者的TKI耐药主要由获得性突变引起，但对应答后样本的体细胞突变还没有进行充分研究。因此，研究者对TKI治疗前后样本的体细胞突变进行分析，最终发现在TKI治疗后，多个个体的NEFH发生突变(图3A-C)。另外，在TCGA携带EGFR突变或ALK重排肺腺癌患者中，NEFH低表达患者有更长的总生存时间和无进展生存时间（图3D-E），表明NEFH是肺腺癌的促癌因子。
为研究NEFH突变与免疫之间的关系，研究者将TKI治疗前的baseline打分减去TKI治疗后的打分，最终得到免疫细胞的相对浸润评分。研究者发现NEFH突变患者的中性粒细胞丰度显著低于NEFH野生型样本(图3F)。另外，Spearman相关分析表明在EGFR 19Del/L858R突变或EML4-ALK融合的TCGA肺腺癌患者中，NEFH表达与中性粒细胞浸润呈正相关(图3G)。与治疗前样本相比，CXCL2等中性粒细胞趋化相关的基因在NEFH突变样本中的表达明显减少(图3H)。
综上所述，以上发现表明TKI抑制剂诱导NEFH发生功能缺陷突变，可能导致中性粒细胞浸润减少，预后更好。然而，细胞毒性细胞的相对水平未见明显变化，表明NEFH突变可能不是TKI处理后细胞毒性细胞浸润增加的主要原因(图3F)。
图3. TKI治疗前后体细胞突变的改变
5.基于加权基因相关网络分析（WGCNA）识别TKI诱导免疫重构过程中的hub基因
为进一步探索TKI诱导的细胞毒性细胞渗透机制，研究者通过WGCNA分析识别TKI诱导免疫重构过程中的hub基因，基于样本中变异程度最高的5000个基因构建共表达网络，最终识别出9个不同的共表达模块 (图4A)。并对模块特征基因与样本临床特征(免疫评分、基质评分、微环境评分等)之间的关系进行探究，以识别与临床特征相关的共表达模块。研究者发现MEblue模块与免疫评分、微环境评分等呈显著正相关，而MEturquoise模块与TKI治疗和免疫评分呈显著负相关(图4B)。因此，研究者将重点放在这两个模块上，基于cytoHubba插件中提供的bottleneck方法分别识别出两个模块中的10个hub基因（图4C-D）。并计算免疫相关评分(IAS，MEblue模块中hub基因的平均表达量减去MEturquoise模块中hub基因的平均表达量)，Spearman相关性分析表明IAS与微环境评分（图4F）和多种免疫细胞类型存在较强相关性。
图4. 基于WGCNA识别TKI诱导免疫重构过程中的hub基因
6. 在TCGA和GSE11969数据中基于IAS打分的免疫相关亚型与免疫浸润、免疫活性和患者预后相关
接着研究者在携带EGFR突变或ALK融合的TCGA肺腺癌患者中基于以上过程中识别出的hub基因计算IAS打分，研究者发现IAS打分与细胞毒性细胞浸润和免疫评分相关(图5A-B)。为进一步评估IAS的预后价值，研究者将携带EGFR突变或ALK融合的TCGA肺腺癌患者基于IAS打分分为两组，其中IAS得分较高患者的预后显著优于较低患者 (图5C-D)。同样，在GSE11969数据集中，也可以观察到EGFR突变患者的IAS打分与免疫重构过程和患者生存时间显著相关(图5E-F)。
图5.IAS打分与免疫亚型
最后让我们来回顾一下本文的主要内容：研究者主要对TKI在EGFR/ ALK阳性非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤免疫微环境中的作用进行探究，发现TKI可以通过诱导免疫微环境重构，激活肿瘤免疫响应过程。然后基于WGCNA识别TKI诱导免疫重构过程中发挥关键作用的hub基因并构建IAS打分，并进一步在公共数据集中基于IAS打分将样本划分为预后及免疫浸润程度不同的两个亚型。
今天的内容就是这些，本篇文章的一个很大优点在于有一手的自测数据，同时很好的结合了公共数据集中的测序数据与预后数据，从多方面论证TKI可以在EGFR/ ALK阳性患者中通过诱导免疫微环境重构，激活肿瘤免疫响应过程。非常值得同学们多多学习哦！
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