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HISAT2,StringTie,Ballgown处理转录组数据

HISAT2,StringTie,Ballgown处理转录组数据

作者: AsuraPrince | 来源:发表于2020-09-07 15:34 被阅读0次

    HISAT2,StringTie,Ballgown处理转录组数据思路如下:

    数据质控

    将RNA-seq的测序reads使用hisat2比对

    samtools将sam文件转成bam,并且排序,为下游分析做准备

    stringtie对每个样本进行转录本组装

    stringtie 将所有样本的转录本进行合并 注意:此处的mergelist.txt是自己创建的

    计算表达量并且为Ballgown包提供输入文件

    Ballgown的安装 分析,需提供一个分组信息;

    0.数据质控(QC):

    Ubuntu软件包内自带Fastqc,故安装命令apt-get install fastqc

    fastqc命令:

    fastqc -o . -t 5 SRR3101238_1.fastq.gz &

    -o . 将结果输出到当前目录

    -t 5 表示开5个线程运行

    (四个样本,双端测序,要分别对八个fastq文件执行八次)

    1.将RNA-seq的测序reads使用hisat2比对

    准备软件:

    安装HISAT2

    下载地址:

    http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/downloads/

    wgethttp://ccb.jhu.edu/software/hisat2/downloads/hisat2-2.0.0-beta-Linux_x86_64.zip-P ./

    解 压 缩:

    unzip hisat2-2.0.0-beta-Linux_x86_64.zip

    准备文件:

    参考基因组序列;genome (chr.fa)

    参考基因组的注释文件;genes (chr.gtf)

    Hisat2索引文件;indexes (chr_tran.1.ht2)

    测序数据;samples (chr_1.fastq.gz, chr_2,fastq.gz;样本表型信息 与 样本列表)

    下载人类参考基因组和注释文件:

    1.1 人类参考基因组:Hisat2官网上有Ensemble GRCh38的基因组索引, 链接:http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml

    1.2 注释文件:下载自ensemble数据库ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-86/gtf/homo_sapiens

    1.3 索引文件的创建:从gtf文件中构建索引,命定如下:

    extract_exons.py hg19.annotation.gtf > exons.txt

    extract_splice_sites.py hg19.annotation.gtf > splicesites.txt

    创建索引另外一种方法:

    hisat2-build [options]*

    <reference_in>:用于指定参考基因组;

    <ht2_base>:用于指定生成的索引文件的基名;

    ./hisat2-2.0.0-beta/hisat2-build -f ucsc.hg19.fasta –ss splicesites.txt –exon exons.txt -p 7 ./ucsc.hg19

    #添加–ss和–exon选项后,需要很大的内存,build 人基因组的话需要200G RAM,如果没有这么大内存,不要添加这两个选项,但要在后续运行hisat时添加 –known-splicesite-infile选项(见下文)

    如hisat2-build -f ucsc.hg19.fasta -p 7 ./uscs.hg19 ##大概需要一小时二十分钟

    (1). 比对,生成bam文件:“将RNA-seq的测序reads使用hisat2比对对参考基因租组”

    hisat2 -q -x ./ucsc.hg19 -1 reads_1.fastq -2 reads_2.fastq -S alns.sam -t

    hisat2 -q -x ./ucsc.hg19 -1 reads_1.fastq -2 reads_2.fastq -S alns.sam –known-splicesite-infile splicesites.txt -t

    -x :用于指定参考基因组所对应的索引文件;

    -1, -2: 用于指定测序 Reads 所在的文件;

    -S:用于指定存储比对结果的文件名;

    -p: 用于指定线程数;

    (2) Sort and convert the SAM files to BAM

    samtools sort -@ 8 -o ERR188044_chrX.bam ERR188044_chrX.sam

    -@:用于指定线程数;

    -o:用于指定存储转化结果的文件名;

    注:*.bam 格式的文件为二进制文件;

    在-b 指定的文件夹下生成特定的文件

    e2t.ctab

    e_data.ctab

    i2t.ctab

    i_data.ctab

    t_data.ctab

    e即外显子、i即内含子、t转录本;

    e2t即外显子和转录本间的关系,

    i2t即内含子和转录本间的关系,

    t_data即转录本的数据

    (3) assemble and quantify expressed genes and transcripts

    stringtie -p 8 -G chrX_data/genes/chrX.gtf -o ERR188044_chrX.gtf -l ERR188044 ERR188044_chrX.bam

    -G :用于指导组装过程的参考注释的文件;

    -o:用于指定存储组装结果的文件名;

    -l: 为转录本的ID指定前缀;

    -p: 用于指定线程数;

    (4) Merge transcripts from all samples:

    stringtie –merge -p 40 -G chrX_data/genes/chrX.gtf -o stringtie_merged.gtf chrX_data/mergelist.txt

    -G :用于指导组装过程的参考注释文件;

    -o:用于指定存储组装结果的文件名;

    -p: 用于指定线程数;

    注: mergelist.txt 文件包含所有*.gtf 文件名的列表, 并且每个文件名占据一行。

    (5) Examine how the transcripts compare with the reference annotation (optional)

    ./bin/gffcompare -r chrX_data/genes/chrX.gtf -G -o merged stringtie_merged.gtf

    -r :用于指定参考的注释文件;

    -o:用于指定存储结果的文件名的前缀;

    -G:用于指定是否比较所有转录本(即使是冗余的);

    (6) Estimate transcript abundances and create table counts for Ballgown

    stringtie -e -B -p 48 -G stringtie_merged.gtf -o ballgown/ERR188044/ERR188044_chrX.gtf ERR188044_chrX.bam

    -e:用于指定是否仅为参考转录本估计表达丰度;

    -B:用于指定是否输出 Ballgown table 文件;

    -p: 用于指定线程数;

    -G :用于指定已组装的注释文件;

    -o:用于指定输出结果的文件名;

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