1 摘要
嵌合抗原受体 T 细胞疗法（Chimeric antigen receptor T cell therapy，简称CAR-T) 利用免疫系统的 T 细胞去识别和攻击肿瘤细胞。从患者体内分离出 T 细胞并对其进行改造以靶向肿瘤相关抗原。CAR-T 疗法已获得 FDA 批准，靶向 CD-19 和 B 细胞成熟抗原用于治疗多种血液肿瘤例如 B 细胞急性淋巴细胞白血病、大 B 细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤等。尽管在血液肿瘤治疗方面取得了成功，但 CAR-T 技术在实体瘤治疗方面仍面临挑战，包括缺乏可靠的肿瘤相关抗原、缺氧核心、免疫抑制肿瘤环境、活性氧增强和 T 细胞浸润减少。 这篇文章汇总了 CAR-T 疗法针对各种肿瘤（血液肿瘤和实体瘤）的演化，重点描述了 CAR-T 所面临的挑战，以及克服这些挑战的策略。
2 简介
1、单克隆抗体显示出对某些癌症的显著疗效。然而，脱靶毒性、免疫原性、耐药性和相当一部分患者对药物缺乏反应等问题仍然存在。这些问题表明癌症的复杂性以及肿瘤与免疫系统之间错综复杂的相互作用，凸显了对创新靶向疗法（如 CAR-T 细胞）的需求。尽管 CAR-T 细胞疗法有其局限性，例如细胞因子释放综合征和潜在的靶向肿瘤效应，但它代表了癌症免疫疗法领域一种令人兴奋且前景光明的方法。与其他疗法不同，CAR-T 细胞经过改造可特异性识别和靶向癌细胞，具有高度特异性
2、这是通过对患者的 T 细胞进行基因改造以表达 CAR 来实现的，CAR 旨在识别肿瘤细胞表面存在的特定抗原。这种独特的属性使 CAR-T 细胞疗法从免疫检查点抑制剂和癌症疫苗等其他疗法中脱颖而出，这些疗法通常依赖于调节患者的免疫系统来对抗癌症，并且经常面临特异性和有效性的问题。此外，CAR-T 细胞疗法已显示出前所未有的反应率，特别是在某些血液系统恶性肿瘤中
3、CAR-T 细胞的“活体药物”性质使其能够在患者体内扩增和持续存在，从而提供持续的抗肿瘤反应，这是许多其他疗法（如单克隆抗体）所不具备的特征。尽管有这些优势，但 CAR-T 细胞疗法并非没有挑战，包括细胞因子释放综合征的风险、神经毒性以及“靶向、非肿瘤”效应的可能性
3 针对癌症和免疫细胞的免疫疗法
3.1 免疫检查点分子
1、免疫检查点分子（如PD-1和CTLA-4）在激活后会与其配体结合，抑制活化T细胞的过度扩增。然而，肿瘤会过度表达这些检查点标记物，以避免肿瘤微环境内的免疫监视
2、免疫检查点抑制剂（ PD-1 /PD-L1抑制剂）通过阻断免疫系统的抑制途径起作用，从而增强免疫细胞更有效地发挥作用的能力。然而，免疫检查点抑制剂也存在某些需要解决的局限性。首先，并非所有患者都对这些治疗有反应。反应率可能因癌症类型而有很大差异，某些癌症的反应率约为 15-20%，而其他癌症的反应率则超过 50%。其次，一些患者可能最初有反应，但随着时间的推移会产生耐药性，导致病情进展。此外，免疫检查点抑制剂可引起免疫相关不良事件 (irAE)，这是由于免疫系统过度激活所致。这些 irAE 会影响任何器官系统，有时可能会很严重甚至危及生命
3.2 肿瘤溶解病毒oncolytic viruses (OVs)
1、OV 是另一类免疫疗法，其利用自我复制的病毒通过接触癌症相关抗原而引起的炎症和细胞死亡来杀死癌细胞。OV 经过改造后，表现出了更强的肿瘤趋向性。这些病毒在体外经过改造后可以感染肿瘤；一旦感染肿瘤，它们就会创造促炎环境并通过溶解途径释放肿瘤抗原。此外，病毒还可以经过改造，在感染肿瘤细胞时表达抗原，从而由于存在免疫原性肽而进一步增强抗肿瘤反应。FDA 已批准三种基于 OV 的临床疗法：RIGVIR、Oncorine 和 T-VEC。用于治疗头颈癌、黑色素瘤等疾病
2、OV的疗效因人而异，取决于免疫系统状态，而且这些治疗有时会被宿主免疫系统迅速清除。此外，OV 的生物安全性是免疫力低下者或服用免疫抑制药物的患者面临的主要问题
CAR-T疗法
见下文
ADC疗法
见上篇文章
4 CAR-T细胞疗法
1、嵌合抗原受体 (CAR) 是基因工程合成受体，可作为免疫效应细胞发挥作用，类似于淋巴细胞 T 细胞。这些受体识别表达特定靶抗原的细胞并将其消除。根据所用细胞的来源，CAR-T 细胞可以分为两类：自体和同种异体。（1）自体CAR-T 细胞来源于患者自身的血液。在此过程中，从患者体内抽取血液，然后进行称为白细胞分离术的程序，该程序分离出白细胞，包括 T 细胞。然后在实验室中对这些 T 细胞进行基因改造，以表达特定的 CAR，使其能够识别和摧毁癌细胞；（2）同种异体 CAR-T 细胞来源于健康供体的血液。在这种情况下，从供体的血液中分离出 T 细胞，然后进行生物工程改造以表达所需的 CAR。这些经过改造的细胞随后被扩增并注入患者体内。这种方法虽然也存在一些挑战，例如潜在的移植物抗宿主病，但它提供了“现成”治疗的可能性，为有需要的患者提供了现成的治疗选择
2、CAR与细胞表面表达的靶抗原的结合不依赖于主要组织相容性复合体（MHC）受体，导致CAR-T细胞的强烈激活和强大的抗肿瘤反应。这是CAR-T细胞相对于其他形式的自适应T细胞疗法的主要优势
3、如图Fig1B所示，第二代 CAR 通常由四个结构域组成：抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和胞内 T 细胞信号传导结构域。 它们的构成和作用如下：
（1）抗原结合结构域是与靶抗原相互作用的胞外结构域。该结构域由单克隆抗体的可变重链 (VH) 和可变轻链 (VL) 组成，它们与丝氨酸-甘氨酸或谷氨酰胺-赖氨酸的短连接肽连接形成单链可变片段 (scFv)；
（2）铰链区或间隔区是连接抗原结合结构域和 CAR-T 细胞外膜的微小结构域。铰链为受体提供灵活性。间隔区的长度取决于抗原表位；通常，使用长间隔区来增加受体的灵活性并提供与膜近端表位的更好地附着。相比之下，短间隔物与膜远端表位的结合效果更好。铰链结构域在 CAR-T 细胞的整体性能中起着至关重要的作用
（3）跨膜结构域位于铰链区和胞内信号传导结构域之间，来源于天然蛋白质，如 CD3ζ、CD4、CD8 或 CD28。跨膜结构域的主要功能是将 CAR 锚定在 T 细胞膜上，它也与 CAR-T 细胞的效应功能有关
（4）胞内 T 细胞信号传导结构域位于膜内，当抗原与抗原结合结构域结合时，CAR 会靠近并聚集在一起，向传导结构域发出激活信号，然后该结构域将此信号传递到细胞内部
5 不同代的CAR-T细胞
1、第一代 CAR 被组合成具有 T 细胞共受体胞内结构域和含 ITAM 免疫受体胞外结构域的单分子。第一代 CAR-T 细胞在临床上是安全的，但却无效。因为它们无法产生足够的共刺激信号来有效杀死靶细胞
2、第二代 CAR-T 细胞被开发出来以提供更好的共刺激，最近已被批准用于治疗多种血液系统恶性肿瘤。最初， T 细胞的共刺激是通过CD28 配体实现的，但 TNFRSF 成员 4-1BB 后来被整合到一些第二代 CAR 中
3、第三代 CAR 具有两个共刺激结构域，最常见的是CD28和4-1BB ，可使 CAR 转导的人T 淋巴细胞具有更强的抗肿瘤效力。与第二代 CAR 相比，第三代 CAR 在与靶抗原结合时具有更高的磷酸化状态，这表明细胞内信号传导更强。磷酸化增强和细胞内信号传导增强使第三代 CAR 具有更显著的扩增并支持分化为记忆亚群。然而，由于第三代 CAR-T 细胞活化程度更高，因此与免疫相关不良反应的风险更大，出于安全考虑，其受到的审查也越来越严格
4、第四代 CAR 转导的 T 细胞被称为“重定向用于通用细胞因子杀伤的 T 细胞”（TRUCK），一旦 CAR 被靶抗原激活，就会释放转基因产物，通常是促炎细胞因子，如 IL-12。这进一步增强了 T 细胞的增殖和功能，更重要的是，将先天免疫效应细胞特异性地募集到肿瘤微环境中，从而诱导更优异的肿瘤杀伤力，同时限制细胞因子介导的全身毒性
5、第五代CAR-T细胞更安全、更高效，其方式是比前代CAR-T细胞多一个胞内结构域，并添加药物依赖性的关闭开关或打开开关，从而分别导致CAR-T细胞耗竭或激活
6 CAR-T 疗法在临床中的应用
6.1 CAR-T 疗法在血液肿瘤中的应用
在过去十年中，包括 CAR-T 细胞疗法在内的免疫疗法显著改善了血液系统恶性肿瘤患者的临床预后。事实上，CAR-T 细胞疗法在治疗淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病方面已预示着良好的临床效果。因此，在过去五年 FDA 批准了多种 CAR-T 细胞产品，用于治疗急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴白细胞、多发性骨髓瘤和不同类型的的淋巴瘤。对有侵袭血液恶性肿瘤且对多种化疗无反应或复发的患者，CAR-T细胞疗法的效果尤为显著。Table1 显示了 FDA 已经批准的 CAR-T 疗法
6.2 CAR-T 疗法在实体癌种的应用
尽管CAR-T细胞疗法在复发或难治性血液系统恶性肿瘤中取得了成功，但它在实体瘤的治疗中仍然面临着挑战。实体瘤具有独特的TME，其特征是血管异常、细胞外基质致密、间质液压、缺氧和免疫抑制细胞的存在，所有这些都是阻止 CAR-T 细胞浸润的因素。除了复杂的肿瘤微环境外，实体瘤CAR-T疗法的一个重大障碍是靶抗原异质性。与ALL或CLL等血液系统恶性肿瘤（其中的肿瘤细胞表达肿瘤特异性抗原）不同，实体瘤很少表达一种肿瘤特异性抗原。实体瘤通常含有肿瘤相关抗原（TAA），它们是在肿瘤中异常表达的自身抗原，而在正常宿主细胞亚群中表达水平较低。
7 CAR-T 细胞疗法的局限性及其改进策略
7.1 细胞因子释放综合征
1、如Fig2a，细胞因子释放综合征 (CRS) 是与 CAR-T 细胞输注相关的最常见毒性之一。当 CAR-T 细胞识别癌细胞上的靶抗原后，就会被激活并开始增殖并释放炎性细胞因子，这时就会发生 CRS。这些细胞因子反过来又可以激活其他免疫细胞，包括单核细胞和巨噬细胞。这些细胞可产生大量炎症细胞因子，如 IL-6 和 IL-1，从而增强炎症反应并导致 CRS 症状。接受 CAR-T 细胞治疗的患者的主要 CRS 症状是高烧、肌肉和关节疼痛、低血压、恶心、疲劳、头痛和皮疹
2、现已采用多种策略来缓解 CRS，包括阻断 IL-6 受体和使用皮质类固醇。FDA 批准用于治疗 CAR-T 细胞治疗后 CRS 的一些单克隆抗体包括托珠单抗、西妥昔单抗和沙利卢单抗
7.2 肿瘤抗原逃逸
1、CAR-T 细胞疗法最具挑战性的局限性之一是在最初的高反应率之后，肿瘤会对单一抗原靶向的 CAR-T 细胞产生耐药性。关于肿瘤抗原逃逸的初步数据主要来自对接受抗 CD19 CAR 的患者进行评估，该患者的 CD19 表达完全或部分丧失，从而导致对抗 CD19 CAR 的耐药性
2、如图 Fig2b 所示，使用双特异性CAR-T细胞一直是对抗抗原逃逸的主要方法，正在开发的CAR-T细胞可以同时识别CD19和CD20或CD19和CD22；这些CAR-T细胞表现出比抗CD19 CAR-T细胞更好的活性。
7.3 运输和肿瘤浸润
1、在实体癌中使用 CAR-T 细胞的最大挑战是将它们送到靶位。这在血液癌症中不是问题，因为循环 T 细胞非常接近其靶标。在实体瘤中，由于免疫抑制性 TME 和物理肿瘤屏障（如基质）限制了 CAR T 细胞的扩散和移动性，这些细胞无法运输和浸润肿瘤，因此 CAR-T 细胞疗法受到限制，如Fig2c。克服异常血管的潜在解决方案是给予针对血管生成因子（如VEGF）的抗血管生成疗法，通过CAR-T细胞疗法使血管正常化
2、为了解决T细胞肿瘤运输问题，其中一种策略是在CAR-T细胞上添加趋化因子受体表达，以匹配并响应来自目标肿瘤的趋化因子
7.4 脱靶毒性
1、CAR-T 细胞疗法中观察到的毒性之一是肿瘤抗原也在正常组织中以不同水平表达，导致对正常组织的攻击，从而产生毒性。B 细胞成熟抗原（BCMA）是免疫疗法广泛使用的靶点。这些抗原在成熟 B 细胞（包括浆细胞）中高度表达，在其他细胞谱系中存在的抗原很少。CAR-T 细胞疗法可导致继发性低丙种球蛋白血症，因为 BCMA 也在健康的浆细胞中表达，将 CAR-T 细胞局部给药至疾病部位是另一种可能限制靶向/非肿瘤毒性的方法
7.5 实体癌缺乏可靠的肿瘤相关抗原
1、实体癌中的 TME 高度异质性，与 ALL、CLL 和 MM 等血液系统癌症中的 TME 不同，这些癌症中的抗原表达是均匀的。然而，在几乎所有实体癌中，TAA 不仅在癌细胞中表达，也在正常组织中表达。这种现象的例子包括常见靶点 EGFR、间皮素、MUC1 和 PSMA。实体癌中的脱靶问题在某些临床试验中导致了灾难性的后果：在一项转移性结肠癌试验中，针对 HER2 抗原的 CAR-T 细胞在输注后 5 天导致患者死亡，如Fig2d
2、为了缓解这一问题，现在正在开发双抗原靶向（需要两种抗原而不是一种抗原来激活 T 细胞）、可诱导自杀基因（在发生严重毒性时可被激活以杀死 T 细胞）和优先与高密度抗原（如在肿瘤细胞上发现的抗原）结合的抗原结合结构域等策略
7.6 克服免疫抑制肿瘤微环境
1、在 TME 中，各种肿瘤浸润细胞，如髓系抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和调节性 T 细胞，有助于免疫抑制，而肿瘤微环境通常被认为对 T 细胞具有敌意。这些肿瘤浸润细胞有助于产生促进肿瘤的生长因子、细胞因子和趋化因子
2、CTLA-4 或 PD-1 等免疫检查点蛋白会导致抗肿瘤免疫力下降。CAR-T 细胞无反应或反应微弱是由于在这种恶劣的肿瘤微环境中 T 细胞扩增不良和 T 细胞持久性有限。T 细胞衰竭的发展是由共抑制途径引起的
3、为了克服这个问题，CAR T 细胞和检查点阻断的联合免疫疗法是一种合理的方法，因为它为强大的免疫反应提供了两个主要要素：CAR T 细胞更好地穿透肿瘤和 PD-1/PD-L1 阻断保持 T 细胞持久性，如Fig2e
8 参考文献
[1] Dagar, G., Gupta, A., Masoodi, T. et al. Harnessing the potential of CAR-T cell therapy: progress, challenges, and future directions in hematological and solid tumor treatments. J Transl Med 21, 449 (2023). https://doi.org/10.1186/s12967-023-04292-3
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