一：慢病毒感染导致细胞状态变差的表现：
慢病毒感染后：
①细胞培养皿的皿底（不是细胞内）出现大量黑点，在排除支原体污染后，最可能的原因是细胞大量死亡后留下的细胞碎片；
②细胞形态变圆、变得透亮，这种情况下是触发了细胞的免疫反应，引起细胞凋亡；
③细胞变得瘦长，不再饱满；
④细胞长势变慢。
二：细胞状态变差的原因：
1.过表达了致死基因，或者敲低了细胞的关键基因，这种情况下可能导致感染了病毒的细胞无法进行长期培养和实验，因此可以构建可诱导表达的慢病毒载体。
2.病毒溶液中残留的杂质蛋白、内毒素等会对细胞造成一定的毒性，不同细胞对毒性的耐受力不同。如果所选择的目的细胞对慢病毒比较敏感，则可能出现细胞状态变差甚至死亡的现象。
①；②，可增加铺板细胞的融合率（可提高至70%），或调整感染时加入的病毒量；③。
三：慢病毒感染细胞注意要点：
1.细胞感染的时机：
保证感染前细胞的生长状态良好；
在对数期生长的细胞中加入病毒，①可在细胞贴壁后加入病毒液；②在细胞传代时（即细胞尚未贴壁时）加入病毒液。根据经验，第二种方法的效果更好。
2.病毒的用量：
①购买的慢病毒：一般都有测过病毒滴度，因此可以根据滴度计算MOI值，MOI代表了一个细胞可能被病毒颗粒感染的次数，对大多数细胞来说，MOI值为10-15时最佳，若病毒一次用量太高，容易造成细胞大量死亡或凋亡。可选择使用高纯度高滴度的慢病毒，并适当降低感染时使用的MOI值。
②对于自己构建载体后利用慢病毒系统包装形成的病毒，则需要用一个病毒梯度来选择最佳方案，既不能直接导致细胞凋亡，也不能表达倍数过低。
③根据细胞状态，可选择在感染4小时后换液，用新鲜的完全培养液继续培养观察
④若需要增加表达倍数，可以分批、分次感染。先感染48h，用载体对应的抗生素筛选48h；待细胞状态稳定后，再次加入病毒，重复感染步骤。
3.PCR验证及WB验证时间：
在最后一次感染后，再培养2代，方可收样进行验证。因为病毒感染对细胞来说，是一种stress，处于胁迫状态下的细胞状态会和正常细胞有所区别。在病毒感染的情况下，细胞免疫系统会被激活，因此，如果研究对象是免疫相关的基因，则受到的影响会更大。
网友评论