Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma
单细胞RNA测序突出了炎症性癌症相关成纤维细胞在膀胱尿路上皮癌中的作用
发表期刊：Nat Commun
发表日期：2020 Oct 8
影响因子：14.919
DOI: 10.1038/s41467-020-18916-5
期刊相关信息
一、背景
膀胱癌（BC）是世界上最流行的泌尿生殖系统恶性疾病之一，每年约有43万个新诊断病例，超过16.5万例死亡。在过去的十年中，肿瘤微环境（TME）一直是癌症生物学研究的一个热门领域，与药物发现的治疗靶点有关。值得注意的是，BC是免疫浸润最低的癌症之一，这可能是抗PD1治疗反应不佳的原因。此前有报道称BC的分子亚型显示出不同的细胞类型特异性表达模式，这表明BC的异质性至少部分来自于微环境中不同的细胞类型部分。
二、材料与方法
1.数据来源
1）8个原发性膀胱肿瘤组织（2个低级别的膀胱尿道肿瘤，6个高级别的膀胱尿道肿瘤）以及3个相邻的正常粘膜
2）公共数据库：TCGA-BLCA数据集；下载了GEO或ArrayExpress数据库中包含超过15个肿瘤样本的基于微阵列的膀胱尿道癌研究，并将其归一化为元队列
3）实验：T24和EJ膀胱尿道癌细胞系
2.实验流程
1）单细胞悬液制备、基于液滴的单细胞测序、原始数据处理和质量控制：剩下52721个单细胞，它们被应用于下游的分析
2）癌细胞中CNVs的估计：使用InferCNV软件包检测EPCAM+细胞中的CNVs，并以默认参数识别真正的癌细胞；两个主要包含非恶性衍生细胞的群组被用作对照组
3）轨迹和RNA速度分析：伪时间分析
4）同步基因调控网络分析：SCENIC是一种新的计算方法，用于构建调控网络和从scRNA-seq数据中识别不同的细胞状态；limma
5）用CellPhoneDB 2进行细胞-细胞通讯分析：CellPhoneDB 2是一个基于Python的计算分析工具，可以在分子水平上分析细胞-细胞通讯；该软件调查了52721个被归类为19种细胞类型的单细胞，以确定交互网络；选择配体属于VEGF、FGF、CCL或CXCL家族且CellPhoneDB返回的P值<0.05的相互作用对，用于评估细胞类型之间的关系
6）与公共数据集的相关性：生存分析
7）路径分析：用clusterProfiler对这些DEGs进行GO富集分析；GSVA；不同细胞组之间的差异用Limma软件包提供的线性模型计算
8）免疫荧光染色、流式细胞仪实验、协同培养集落形成实验
三、实验结果
01 - 癌细胞因CNV模式而表现出高度异质性
经过质量控制和去除批次之间的批次效应，52721个单细胞被聚类为八个主要集群。集群中的特异性基因被用来注释细胞类型：上皮细胞（EPCAM+）；内皮细胞（CD31+）；两种类型的成纤维细胞（COL1A1+）-iCAFs（PDGFRA+）和肌CAFs（mCAFs）（RG5+）；B细胞（CD79A+）；骨髓细胞（LYZ+）；T细胞（CD3D+）；和肥大细胞（TPSAB1+）（图1a, b, 补充图2A-D）。
补充图2 鉴定 BC TME 中的主要细胞类型。
EPCAM+上皮细胞（EPCs）被重新分为17个集群（图1c，d）。虽然之前已经消除了批次效应，但癌细胞仍然显示出患者特有的表达模式，这表明异质性极高，可能是由拷贝数变异（CNVs）引起的；这一假设被InferCNV证实（图1c，补充图3A）。如补充图3A所示，CNVs在大多数高级别肿瘤衍生的EPCs中积累，并在集群中表现出高度异质性。尽管存在异质性，但几乎所有的高级别癌症细胞都拥有9号和11号染色体的缺失和19号和20号染色体的扩增。此外，一些来自肿瘤组织的细胞几乎没有CNV，并显示出与正常EPCs相似的表达模式（图1d），这表明这些细胞可能是非恶性EPCs。因此，在这项研究中，根据CNVs将EPCs分为4组：低、高、对照和未检测到。
补充图3
当比较转录组时，作者注意到一系列的基因在对照组和未检测到CNV的组中特别表达，但在肿瘤细胞中几乎没有表达（图1d）。GO分析显示，这些基因富集于免疫相关途径，特别是B细胞相关途径（图1e）。与正常上皮细胞相比，癌细胞几乎失去了产生免疫球蛋白的能力，而且它们表达的MHC-II分子水平较低，这一点通过免疫荧光得到验证（图1f，g）。这些结果表明，膀胱癌细胞可能下调免疫原性以逃避免疫检测。此外，拥有更多CNVs的癌细胞似乎表达更高水平的IGF2（补充图3B，C）。在TCGA BLCA队列中，IGF2的高水平与预后不良有显著关系（补充图3C）。用GSVA进行的通路分析显示，E2F靶点、MYC靶点和G2M检查点途径在CNV高组中富集，而炎症和其他免疫相关途径被下调（图1h）。这些结果进一步证实，BC晚期的癌细胞下调了免疫原性，并表现出高增殖能力。
图1 识别BC和非恶性组织中的浸润细胞类型
02 - 被招募到肿瘤区域的单核细胞经历M2极化、LAMP3+ DCs通过细胞因子招募Tregs进入肿瘤区域
髓系细胞的重新分类确定了七种细胞类型：肿瘤相关巨噬细胞（TAMs，MRC1+C1high）；CD1C+树突状细胞（CD1C+ DCs，CD1C+CLEC10A+）；单核细胞（S100A8+S100A9+）；增殖型骨髓细胞（TOP2A+）；交叉呈递型DCs（CLEC9A+）；滤泡B细胞（CD79A+MS4A1+）；和LAMP3+DCs（LAMP3+CCR7+）。有两个细胞群既表达骨髓标志物，又表达上皮或内皮标志物，它们被认为是双胞胎（图2a，补充图5A-C）。细胞类型之间的差异也可以通过TF图案的活性来确定（补充图5D）。单核细胞大多来源于正常的粘膜组织，而TAMs则富集在BC组织中，此外这两种细胞类型的转录组似乎表现出持续的变化（图2b，补充图5B），表明招募到肿瘤区域的单核细胞被重新编程为TAMs。
补充图5
为了进一步研究这个持续的过程，作者对单核细胞和TAMs进行了轨迹分析和RNA速度分析（图2c）。结合SCENIC确定的关键图案，认识到BACH1、MAFG和NFE2三个图案的活性被下调，而MAF、STAT1和STAT2图案的激活导致了这种M2极化过程（图2c、d）。这些结果为抑制或逆转免疫抑制性微环境的形成提供了潜在的目标。此外在这个分化过程中，共抑制剂CD274、LGALS9、CD276、TIGIT和PDCD1LG2都被上调，而共激活物被下调（图2e）。
图2 髓源性细胞（LYZ+）的重新聚集
在3个DC亚群中，LAMP3+DCs表达各种编码细胞因子的基因，包括CCL17、CCL19和CCL22（图2f），这些细胞因子几乎全部来自BC的LAMP3+DCs（图2g）。在TCGA BLCA队列中，LAMP3+ DC特征与Treg特征和Th2特征高度正相关，它们都是CCR4+，但与CTL特征没有高度相关性（图2h），LAMP3+ DCs在肿瘤组织中明显富集（补充图5A）。此外，LAMP3+ DCs显示出最高水平的CD274（图2f），甚至高于在BC组织中观察到的Tregs，表明该DC亚群可以直接或通过招募Tregs进入肿瘤区域而抑制CD8+ T细胞。SCENIC分析显示，RELB和KDM2B主题在LAMP3+ DCs中被高度激活（补充图5E-G）。
03 - 在BC中发现了两种不同的成纤维细胞亚型
成纤维细胞（COL1A1+）被聚类为两种不同的类型；PDGFRA+成纤维细胞表现出各种细胞因子和趋化因子的强烈表达，包括CXCL12、IL6、CXCL14、CXCL1和CXCL2；RGS5+成纤维细胞的特征与肌癌相关的成纤维细胞（mCAFs）相似（图3a，b）。通过免疫荧光法评估肿瘤和非恶性膀胱基质组织中现有的iCAFs和mCAFs（图3c），结果表明CAFs在不同的癌症类型中拥有相似的亚群。
为了研究每个亚群的功能，作者对iCAFs和mCAFs的DEGs进行GO富集分析。如图3d所示，iCAFs与细胞外基质组织、细胞迁移调节和血管生成有关，而肌肉系统过程、焦点粘附和细胞外基质相关途径在mCAFs中明显富集。GSEA同样显示，iCAFs与细胞外基质降解有关，表明其在肿瘤转移中的潜在作用。细胞因子-细胞因子受体相互作用途径也在iCAFs中富集。相反，肌肉收缩和PGC1A途径在mCAFs中富集（图3e，f）。
由于细胞因子-细胞因子受体的相互作用在iCAFs富集，作者探究了BC TME中细胞因子的表达水平。iCAF是CXCL12的主要来源，这与TAMs通过CXCL12/CXCR4的相互作用而积累有关。CXCL12与TCGA BLCA队列中的TAM特征呈正相关，较高的CXCL12水平与预后不良明显相关。免疫荧光染色证实，CXCL12在BC组织中由iCAFs表达（图3g-j）。
图3 BC中的成纤维细胞可以分为两个不同的亚群
04 - iCAFs在BC中具有促进增殖的作用
通过SCENIC分析，作者确定了两个CAF亚群。MEF2D和MEF2C是mCAF特异性基序，在肌肉系的转录调控中具有深刻的作用；TCF21和TWIST2图案在iCAFs中被高度激活（图4a，b）。
通过GO富集，预测iCAFs具有生长因子活性。为了证实这一假设，作者分析了BC TME中VEGF、FGF和IGF家族的表达水平（图4c）。iCAFs是各种生长因子的主要来源，在这些生长因子中，IGF1，一个iCAF特异性的群体因子，与总生存率低有关（图4d，e）。
为了验证其促增殖作用，作者用流式细胞仪对iCAFs进行分类，并在体外将其与膀胱尿道癌细胞系共同培养。共培养组显示出更高的增殖能力，这证实了iCAFs在BC中的抗肿瘤作用（图4f,g）。
图4 iCAFs促进癌细胞的增殖
05 - 将scRNA-seq与公共数据集相关联
作者用CIBERSORTx评估了TCGA BLCA队列样本中每种细胞类型的比例（补充图7A-C）。只有iCAFs和mCAFs的积累与较差的总生存期（OS）有关（图5a,b）。当把细胞分数数据与临床信息联系起来时，在以前的研究中描述的分子亚型中，细胞类型的丰度有很大的改变（图5c，d）。肿瘤纯度最高的Luminal乳头状，预后最好，而其他四组的OS没有显示出明显的差异。基底鳞状细胞显示出最低的肿瘤纯度，T细胞也在这组中富集，表明抗免疫检查点疗法可能适合这些患者。与其他细胞类型相比，除管腔-毛细血管组外，mCAFs和iCAFs在四个组中都富集。由于管腔-毛细血管组主要包含早期的样本，这些结果表明CAFs与BC的肿瘤进展密切相关。此外，在肿瘤组织中，成纤维细胞标志物明显下调，而上皮细胞标志物则上调。由于正常的膀胱粘膜主要包含EPCs，而成纤维细胞主要位于基质组织中，这种现象可能是采样深度的结果。这可能掩盖了正常上皮细胞和肿瘤细胞之间真正的DEGs的鉴定（补充图7D，E）。
补充图7
作者扩大了临床队列，从GEO和ArrayExpress数据库中收集了超过3000个微阵列分析的BC和非恶性粘膜样本，用ConsensusClusterPlus将2959个肿瘤样本聚类为五大组（补充图8A-C）。四个主要聚类显示了类似于管状-乳头状、管状、管状-浸润和基底-鳞状聚类的特征。另一个集群与TCGA BLCA中的神经组不同，它同时表现出腔镜-鳞状和腔镜的特征，所以被命名为腔镜过渡。如图5e-h所示，该meta队列的OS与TCGA的OS高度吻合，表明CAFs在BC进展中的重要作用。iCAF和mCAF有很多相似的特征，这可能使CIBERSORTx的结果不充分。在来自TCGA的队列中，iCAF特异性标志物PDGFRA与BC患者的不良OS明显相关，而mCAF标志物RGS5则没有，表明iCAF可能比mCAF有更重要的作用（补充图7F）。
图5 BC的分子亚型是由TME的异质性引起的
补充图8
06 - 构建一个基于iCAF的BC监管网络
使用CellphoneDB2，作者研究了本工作中确定的细胞类型之间的细胞-细胞相互作用网络。iCAFs与其他细胞类型显示出最多的相互作用，而且它们与ECs显示出特别强的相互作用（图6a）。考虑到GO分析和GSEA的结果以及表达丰度，作者收集了包括生长因子、CCL和CXCL家族的相互作用对数据。iCAFs表达较高水平的CXCL12，其受体包括DPP4、CXCR3、CXCR4和ACKR3（CXCR7）。由于CXCR4和CXCR3在免疫细胞上广泛表达，iCAFs分泌的CXCL12是BC的免疫浸润状态的原因。iCAFs分泌的CCL2和CXCL1可与ACKR1相互作用，后者在ECs表面高度表达。这些细胞因子以前被报道与BC的转移有关，作者把它们的来源锁定在iCAFs（图6b，d）。
iCAFs产生VEGF，包括VEGFA和VEGFB，它们与ECs上的VEGF受体（FLT1、KDR、MET和FLT4）结合，促进血管生成。此外，FGFR1表达在iCAFs和ECs上，而FGFR3表达在肿瘤细胞上。这些受体可与FGF结合，包括来自iCAFs的FGF2和FGF7，并显示出促增殖作用。IGF1R是IGF1的受体，在肿瘤细胞和基质细胞上表达，这表明iCAF也可能是对顺铂产生抗性的因素。值得注意的是，肿瘤细胞表达高水平的VEGFA，它具有最强的促血管生成能力。此外，高级别肿瘤细胞高度表达IGF2，与iCAF上的IGF2R相互作用，并促进肿瘤的进展（图6c，e）。总之，iCAFs可以促进肿瘤细胞和基质细胞的增殖，并有可能能够招募免疫细胞进入肿瘤阶段。
图6 BC TME中的细胞-细胞通信网络
四、结论
综上所述，作者确定了膀胱尿道癌中细胞亚群的表达谱，并证实了这些肿瘤相关亚群的特征。这个细胞图谱提供了对癌症免疫学的深刻见解，是未来药物发现的重要资源。
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