细胞冻存

1. 按照细胞培养流程，将对数生长期的细胞吹下来加入50mL离心管中，200g离心5min。

2. 配制冻存液，90% 血清，10% DMSO，混匀。

3. 离心后去上清，将配制的冻存液加入，将细胞吹匀。

4. 取上述溶液每1mL分至1.5mL 细胞冻存管中，做好标记和日期。

5. 将冻存管放入装有异丙醇的冻存盒中，放入-80℃冰箱过夜。（冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温，使异丙醇的温度达到室温，每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上）；

6. 第二天将冻存盒放入液氮或 -150℃冰箱中以长期保存；同时取一支细胞做复苏检测，以判断该批细胞的冻存质量。

细胞复苏

1. 10cm dish中加10ml新鲜DMEM培养基，放培养箱预热至37℃。

2. 从液氮中取出冷冻管，迅速投入 37 ℃～38℃水浴中，使其融化（1-2 分钟左右）。

3. 待细胞冻存管中溶液融化后，200g离心5min，弃掉液体并吸取1ml预热的培养基将细胞沉淀轻轻吹起，转移到10cm dish中。

4. 摇晃均匀，置于培养箱培养。

5. 培养过夜，更换新鲜培养基（除去冻存液中DMSO对细胞的毒害作用）。

细胞传代（以10cm dish为例）

1. 生物安全柜紫外灭菌半小时。

2. 灭菌期间，将DMEM培养基(含10%FBS，1%青链霉素混合液)和PBS置于37℃水浴锅中预热；0.25% 胰酶放置室温，不可水浴加热。

3. 取汇合度接近100%且活性较好的HEK293T 细胞，吸弃培养盘中培养基，加入约5mL，1×PBS，摇晃几下，吸弃PBS。

4. 加1mL 0.25% 胰酶在生物安全柜内消化约1min，室温低时可放置于培养箱中消化。消化时间不宜过长，否则影响细胞再次贴壁效率和活性。

5. 加入约5mL预热的培养基，终止消化。

6. 用移液管吹打均匀（吹打过程中不可用力过大，否则会吹破细胞），按照1:3的比例传代。各取2mL培养基至新的10cm dish中，再加入 8mL预热的DMEM 培养基。

注意：

传代盘数较多时，要先将预热的 DMEM 培养基加入到 10cm dish中，再加入含细胞的培养基，以避免细胞分布不均匀。置于培养箱前轻轻混匀dish中的培养基，使细胞均匀分散于培养基中。