文献信息

"Development and optimization of thermal contrast amplification lateral flow immunoassays for

ultrasensitive HIV p24 protein detection"

Microsystems & Nanoengineering (2020) 6:54

https://doi.org/10.1038/s41378-020-0168-9

美国明尼苏达大学机械工程系

摘要

在护理点(POC)环境中以单pg/ml浓度检测人类免疫缺陷病毒(HIV) p24蛋白非常重要，因为它可以促进急性HIV感染诊断，检测灵敏度接近基于实验室的检测。然而，最主要的POC诊断平台——横向流动免疫分析法(LFAs)的检出限(LOD)低于酶联免疫吸附试验(ELISA)等实验室蛋白检测方法。在这里，我们报道了热对比扩增(TCA) LFA的开发和优化，该LFA将允许在POC时超灵敏地检测8 pg/ml p24蛋白，接近实验室测试的LOD。为了实现这一目标，我们进行了以下几项创新:(a)基于特异性与非特异性结合比(BR)定义了LFA设计的新量化指标；(b)在TCA LFA设计中使用不同尺寸和形状的GNPs进行系统优化；(c)探索TCA LFA设计的新激光波长和功率机制。首先，我们利用TCA阅读器定量测量BR，优化了膜的阻塞缓冲液和运行缓冲液。TCA阅读器在粒子的等离子体共振波长处被激光照射时，解释膜内GNPs的热信号(即温度)。这一过程导致更高的检测和定量的GNPs比传统的视觉检测(即颜色强度)。此外，我们还研究了激光功率(30、100、200 mW)的影响，GNP大小和形状(30和100 nm 金球体，150 nm 金-硅壳)，激光波长(532,800 nm)。将这些创新应用到新的TCA LFA设计中，我们证明了100 nm球体与100 mW 532 nm激光提供了最佳性能(即 LOD =8 pg/ml)。该LOD明显优于目前的比色LFA，在实验室p24 ELISA的范围内。总之，p24蛋白的TCA LFA显示出在POC环境中检测急性HIV感染的前景。

Fig. 1 Thermal contrast amplification (TCA) reader can be used to probe specific binding (SB) and nonspecific binding (NSB) at various locations of LFA membrane. a Background and test line areas on LFA membrane are irradiated with a laser, resulting in different temperature increases due to distinct SB and NSB events and therefore establishing an SB/NSB ratio, which we defined as a new figure of merit called the binding ratio (BR). b For background area on the LFA membrane, analytes can nonspecifically bind to the nitrocellulose membrane, which could therefore capture GNP conjugates. NSBs occur between GNP conjugates with nitrocellulose membrane via hydrophobic and electrostatic interactions. In addition, aggregated GNPs can be trapped within the nitrocellulose pores. c For the test line area, SB refers to the sandwich interaction between the GNP conjugates, analyte and capture antibody on the membrane. Besides all the possible NSBs for the background area, another important NSB case in test line area is between GNP conjugates and the capture antibody

结果与讨论

GNP合成

Fig. 2 Characterization of various GNPs and optimization of antibody conjugation. a–c TEM images of 30 and 100 nm gold nanospheres and 150 nm gold nanoshells. The insets are the images of GNP solution showing red, muddy brown and blue colors for 30 and 100 nm gold nanospheres and 150 nm gold nanoshells, respectively. d Normalized UV-Vis-NIR spectrum of 30 nm and 100 nm gold nanospheres and 150 nm gold nanoshells. e, f Optimization of GNPs (30 and 100 nm)—1E5 antibody passive absorption by varying the amount of 0.2 M K2CO3 and antibody added to 1 ml GNP as-synthesized solution. Success conditions (star symbols) avoid GNP aggregation (cross symbols) and severe nonspecific bindings at test line (i.e., false positives, square symbols). The circled success conditions provide strongest control line (i.e, specific binding) with minimal consumption of antibody

GNP-1E5 Ab偶联物

在决定LFAs的最终LOD和特异性方面，GNP共轭起着至关重要的作用。成功的GNP偶联物应对目标分析物具有特异性和高结合亲和力，以实现低LOD和与硝化纤维膜和测试系抗体的低非特异性相互作用，以避免假阳性(即高特异性)。对于柠檬酸盐稳定的GNPs，抗体可以强烈吸附到GNP表面形成稳定的缀合物，同时保留其结合活性。一般来说，这种被动偶联可归因于静电相互作用(即，带负电荷的GNP表面和抗体上的带正电荷的位点)，疏水吸引(即，抗体和金表面)以及抗体的金原子和硫原子之间的共价键。静电和疏水相互作用通常是最佳共轭的主要考虑因素。为了达到这一目的，pH值需要保持在或略高于抗体的等电点。等电点是指分子不带净电荷的pH值。在较高的pH值下，抗体携带净负电荷。带正电的抗体会导致带负电的GNPs聚集。中性或略带负电荷的抗体有助于与GNP表面结合并保持粒子间的稳定性。pH值可以通过在引入抗体之前向GNP溶液中添加0.2 M K2CO3来调节。另一个重要参数是使用的抗体量。更高的表面抗体包覆密度提供了更强的SB。然而，如果覆盖抗体，GNP偶联物会增加测试线上的NSB，从而导致假阳性。为了减少这种NSB，通常添加BSA来阻塞GNPs上的自由表面。

作者通过改变pH值和增加1E5体积优化了1E5抗体-GNP(30和100 nm)的偶联。对于1 ml合成的GNPs，加入1-6 μl 0.2 M K2CO3，使pH由5调整为9，添加量为0.1 ~ 10 μl的1E5。如图2e,f所示，不同抗体与K2CO3添加量所获得的结果范围从由于GNP聚集和假阳性而失败到最终成功。例如，在低K2CO3体积下(即pH <7)， GNPs聚集，可能是由于抗体的正电荷低于等电点。在中等K2CO3体积(即pH~7)下，GNP的偶联物是稳定的，在由p24蛋白组成的对照系上显示出清晰的红色，表明偶联成功。值得注意的是，控制线颜色强度随着抗体体积的增加而增加，这是强SB的结果。然而，当偶联抗体体积过高时，会出现假阳性(即失败)，可能是由于GNP偶联物与测试系抗体之间的NSB增加。最后，在高K2CO3体积 (即pH为>7) 下，需要更高的抗体体积才能获得与pH为~7时相当的控制线，这表明偶联不理想，不需要抗体。因此，在接下来的LFA优化中，我们使用3 μl 0.2 M K2CO3调节到pH=~7和出现假阳性之前的最大允许抗体体积的偶联条件。

NC膜封闭缓冲液优化

膜是LFA的关键组成部分，而硝化纤维膜因其孔径可调、蛋白结合能力高和制造工艺可控而最常用。通常，添加制造商的专有化学涂层，将疏水性硝化纤维修饰为亲水的毛细流动。T线和C线蛋白质通过静电和疏水相互作用结合到硝化纤维膜上。此外，由于其蛋白质结合特性，GNP缀合物甚至分析物可以非特异性地结合到硝化纤维膜上，导致背景。为了阻断这些额外的蛋白质结合位点，在组装LFA之前，通常将膜浸泡在由大分子和表面活性剂组成的阻断缓冲液中。另一方面，在LFA测试过程中，也可以在运行缓冲液中加入阻断剂来阻塞膜。高浓度的阻断剂可以降低NSB，但也会干扰SB，从而影响LFA的灵敏度和性能 (SB/NSB比)。定量比较各种阻断溶液对LFAs中SB/NSB比值的影响是很重要的。通过跟踪膜背景上GNPs的颜色强度来进行这种定量比较是不可能的，因为它可以是亚视觉的，并且差异低于扫描仪或肉眼的分辨率。

由于阳性p24样品在测试线上SB和NSB总是共存的，通过使用阴性样品，在控制线上喷涂p24，我们可以在单个LFA测试中实现SB(即T线)和NSB(即C线)的解耦。因此，对控制线信号的比值进行T线信号表示SB/NSB比值 (图3a)。在图3b中，我们使用TCA读取器在运行排除p24蛋白的缓冲液测试LFAs后，定量地获得了测试和控制线上的GNP分布。为了获得足够的温度变化(即ΔT)，同时避免烧毁膜，分别使用30和10 mW的激光功率进行测试线和控制线扫描。为了解释图3b所示的温度变化曲线，我们首先将曲线分为两部分:背景区域和测试(或控制)线区域。图1b所示的NSB类别1 (GNP缀合物与膜之间)和类别2 (GNP缀合物物理困在膜中)可以从背景区域的温度上升中推断出来。同样，在测试线上额外的温度升高代表NSB类别3 (GNP偶联物和测试线上抗体之间)，如图1b所示。为了获得测试线上的最终热信号，我们首先对背景区域的ΔT取平均值，然后将其从测试线上区域的平均值△T中减去。因此，当测试一个阴性样本时，这个测试线信号将用于代表NSB类别3。对控制线温度曲线进行了类似的处理以获得SB。

我们用30 nm的球缀合物对膜阻滞缓冲液和流动缓冲液进行了优化。为了减少对SB的干扰，我们选择使用最小阻塞剂。我们加入各种浓度(即，0.1, 0.5，和1%)的BSA到磷酸盐缓冲液(PB)在不同的离子浓度(即，10和30 mM)。运行缓冲液使用60 mM Tris, 0.5% BSA和0.5% Triton (pH=7)。LFA条带图像如图3c所示。值得注意的是，根据视觉强度(即肉眼)检查，大多数条看起来相似。图3d显示了使用不同膜阻塞缓冲液时，TCA在定量比较SB和NSB方面的优势。例如，对于10 mM PB，添加0.1% BSA比添加0.5和1% BSA的NSB要高；然而，1%的BSA会导致SB的降低。因此，当使用10 mM PB时，添加0.5%的BSA可获得最高的BR。此外，在相同的BSA浓度下，将PB浓度从10 mM增加到30 mM，通过增加NSB和降低SB来降低BR。有研究报告称，增加离子强度倾向于降低抗体-抗原结合常数。高离子强度下NSB的增加可能是由GNP缀合物的变化引起的，有待进一步研究。总的来说，我们确定了BR最高的10 mM PB+ 0.5% BSA作为膜阻断缓冲液，以进行进一步的优化步骤。

Fig. 3 Quantitative optimization of membrane blocking buffer and running buffer for TCA LFA. a The architecture of TCA LFA used for SB/NSB optimization. b TCA reader will scan the test line and control line areas separately. The resultant temperature curve was analyzed in two steps: the background temperature change was first averaged and then subtracted from the average test line (or control line) temperature change. c Images of LFA tested with various membrane blocking buffers and running buffers using negative p24 samples. Note that the test line and background stain were all invisible (i.e., subvisual). d Test line temperature signal (ΔT @ TL), control line temperature signal (ΔT @ CL) and their ratio (i.e., SB/NSB ratio) were plotted against various membrane blocking buffers. ΔT @ TL represents NSB as negative p24 sample was used and ΔT @ CL represents SB as p24 was sprayed as the control line. e ΔT @ TL, ΔT @ CL and their ratio were plotted against various running buffers. The buffer with highest SB/NSB ratio was marked with a star

Running buffer优化

运行缓冲区是调节和减小NSB的另一个关键部件。各种盐类、表面活性剂和大分子通常包含在运行的缓冲液中。一般来说，需要针对每个LFA优化运行缓冲区。对于缓冲成分，我们在不同pH值 (7和8) 下测试了Tris (20和60 mM)、BSA (0和0.5%) 和Triton X-100(0和0.5%)的各种组合。使用GNP共轭物(30 nm)和10mM PB+0.5% BSA阻塞的膜。同样，基于颜色强度的简单视觉检查无法定量地比较各种运行缓冲液 (图3c)。如图3e所示，BSA与Triton X-100的组合比单独使用BSA或Triton X-100的NSB(即ΔT @ TL)更低。pH从7增加到8大大降低了NSB，同时也损害了SB。此外，将Tris浓度从60 mM降低到20 mM会导致NSB的增加。因此，60 mM Tris +0.5% BSA+0.5% Triton (pH= 7)的性能优于其他缓冲液，表现出最高的BR(即ΔT @ CL/ΔT @ TL)。事实上，这些趋势可能是抗体依赖的，并且可能因试验而异，因为每个LFA使用不同的抗体。每种单克隆抗体或多克隆抗体可能对缓冲液组成、GNP偶联条件、NC膜等的变化做出不同的反应。重要的是，TCA阅读器允许定量分析单个LFA内的GNP分布，这可以提供关于这些SB和NSB在不同检测配置下如何变化的有价值的信息。

p24 TCA LFA的最佳LOD

为了使TCA LFA的性能最大化，作者研究了包括激光功率、GNP大小和形状以及激光波长在内的重要参数。对于不同的GNP大小和形状，在之前的工作中发现，用100 nm球体的TCA读取器检测取代传统30 nm球体的视觉颜色强度检测，可以实现LFA中两个数量级的LOD增强。后来又有研究证实，较大的GNPs确实可以提高LFAs的检出限。此外，我作者报道了进一步将金纳米球的尺寸增加到100 nm以上可能会导致沉降，因为金纳米球的质量很重，因此减少了超过100 nm的更大尺寸的好处。具有二氧化硅核心的金纳米壳可以减少纳米颗粒的重量，同时保持较大的尺寸以获得更好的光学性能和更高的抗体负载以获得更好的结合。这种改进是由于二氧化硅的密度(即2.65 g/cm3)比金(19.32 g/cm3)更轻，其中10纳米厚的金壳层可以调节到近红外范围(即780-2500 nm)。当近红外激光用于TCA阅读器时，这种方法将减少来自硝化纤维膜和LFA衬底的激光吸收。

在这里，作者选择了150 nm的硅核金纳米壳以及30和100 nm的金纳米球来比较p24 TCA lfa中的LOD。硝化纤维膜阻滞缓冲液和流动缓冲液的最佳配方如图3所示。首先测试阴性样品(即不含p24的运行缓冲液)，以建立阴性对照的热信号。然后，先用运行缓冲液对具有30 nm球形、100 nm球形和150 nm壳体的LFAs进行两倍连续稀释。这些标记p24浓度的LFAs图像如图4a-c所示。30 nm球、100 nm球和150 nm壳的视觉检出限分别为250、62和62 pg/ml。

Fig. 4 Ultrasensitive p24 detection with an optimized LFA and TCA reader. a–c Images of p24 LFAs tested with twofold serial dilutions of p24 using 30 nm spheres, 100 nm spheres and 150 nm shells, with visual LODs of 250, 62 and 62 pg/ml, respectively. The numbers indicated in the image are the p24 concentrations in pg/ml. Visual and thermal LODs are marked with one star and two stars, respectively. d–f Quantitation of p24 concentration in LFAs with the TCA reader. The thermal LODs for LFAs with 30 nm spheres, 100 nm spheres and 150 nm shells are 32, 8 and 16 pg/ml, respectively. g For LFAs with 100 nm spheres, increasing the TCA reader laser power from 30 to 100 mW improved the LOD from 16 to 8 pg/ml. Further increasing the laser power to 200 mW resulted in the same LOD as that with 100 mW laser power, revealing that NSB dominates SB at low p24 concentrations (i.e., <8 pg/ml) and that increasing the laser power fails to detect the SB. p < 0.05. h Summary of visual and thermal LODs of p24 LFAs with 30 nm spheres, 100 nm spheres and 150 nm shells

接下来，我们探讨了是否增加激光功率可以进一步提高LOD，因为GNPs产生的热量与激光功率成正比24。采用30、100和200 mW不同功率的激光，以0 ~ 32 pg/ml的p24浓度照射100 nm球形LFAs。为了确定LOD，我们在公式1中选择 k=3，这意味着LOD样本将高于负样本的平均热信号加上其标准差的三倍。当激光功率从30 mW增加到100 mW时，LOD从16 pg/ml下降到8 pg/ml，但当激光功率增加一倍至200 mW时，LOD仍保持在8 pg/ml (图4g)。这一结果表明，提高激光功率可以在一定程度上改善p24 LOD，但限制p24 LOD改善的因素是测试线上缺乏特异性结合的GNPs，这些GNPs可以通过TCA与非特异性结合的GNPs(即阴性样品)区分开来。此外，我们还研究了激光波长对TCA lfa增强性能的影响。具体来说，当激光功率设置为100 mW时，分别使用532 nm和800 nm激光用于基于30nm球体、100nm球体和150 nm壳体的TCA lfa。确实，当激光波长与GNP光谱峰值相匹配时，LOD增强 (即与视觉检测相比) 达到最大，例如，532 nm激光用于30 nm和100 nm球体，800 nm激光用于150nm壳体(表S2)。此外，我们使用传统方法(即肉眼)建议的次优缓冲选择，对30 nm球体进行了p24测试。例如，根据图3b所示的测试和控制线的颜色强度，膜阻挡缓冲液1(即10 mM PB+0.1% BSA)和运行缓冲液1 (60 mM Tris +0.5% BSA)显示出强烈的控制线，而测试线可以忽略不计。在这种情况下，我们证明了使用BR作为优劣图(图S1)，通过最佳缓冲选择(即膜阻塞缓冲2和运行缓冲3)，可以实现4倍的低热LOD。这一结果表明，我们的BR优化新策略可以简化LFA开发过程，并提供更好的LFA最终性能(表S1)。

为了比较不同GNPs，激光功率设置为100 mW。对于三种不同的GNPs，结果绘制在图4d-f中。30 nm球、100 nm球和150 nm壳层的热LOD分别为32、8和16 pg/ml(图4h)。特别地，TCA阅读器显示了所有GNP类型的p24定量。如果一个人能够在不稳定的情况下继续增加GNP大小，那么就可以预期LOD的改善将继续下去。然而，这并没有发生在150纳米的壳层上，而是发生在100纳米的球层上。具体来说，是更高的温度变化与100 nm-球形LFA(即0.5°C)相比，我们注意到150 nm-壳LFA的测试线上(即，1C)，表明纳米壳缀合物和测试线抗体之间的NSB增加(图4e, f)。在所有情况下，我们表明SB/ NSB比值在使用TCA LFA检测尽可能低的分析物浓度中起着决定性作用。为了证明我们的超灵敏p24 TCA LFA的实际用途，我们将p24蛋白添加到人血清中，并使用100 nm球形TCA LFA和100 mW 532 nm激光进行稀释试验。我们证实，与添加8 pg/ml的缓冲液相比，热LOD保持不变，这表明我们的TCA LFAs在复杂的生物环境中表现良好(图S2)。