10xGenomics单细胞测序平台自2018年问世以来，被广泛的应用到科学研究的各个领域，在描绘组织发育图谱和探究疾病致病机制方面做出了巨大贡献，成为测序领域的“流量之王”。
利用10xGenomics平台进行单细胞测序时，大部分研究者会首选新鲜离体的样本消化成单细胞悬液，但这种方式并非对所有组织都适用（见表一），因此需要选择另外一种方式：组织抽核，即从组织中直接将细胞核提取出来，制备成单细胞核悬液进行单细胞核转录组测序。
表一不推荐单细胞悬液制备的组织及原因
两种样本处理方式（消化成单细胞悬液vs组织抽核）都有各自的优势及适用的组织类型（见表二），在进行单细胞测序前，需要根据组织类型、研究目的、样本获取状态等综合考虑确定样本的处理方式。
表二单细胞悬液消化vs组织抽核
诺禾单细胞团队自2019年成功研发组织抽核以来，已承接各种组织类型的抽核服务，故推出了单细胞样本制备之组织抽核系列，旨在跟大家分享交流组织抽核的项目经验。此系列涉及到脑、肝、肾等不同的组织类型，本期我们主要展示常见的脑/神经组织，其他组织类型后面会陆续推出，敬请期待！
脑/神经组织抽核实验流程
1.样本置于干冰中转移至室验台；
2.用镊子从冻存管中取出组织，放入研磨器研磨，至视检无明显的组织团块；
3.研磨后组织于裂解液中冰上裂解3-20 min（裂解时间根据组织类型及裂解液的种类不同有所差异）；
4.裂解后的悬液通过30um的滤筛；
5.滤液离心清洗一次；
6.密度梯度离心，得到细胞核；
7.清洗后，显微镜下质检；
在整个组织抽核实验中用到的关键试剂就是Lysis Buffer，主要原理就是利用表面活性剂使细胞膜破裂，细胞核从组织中释放出来，Lysis Buffer成分组成见表三。Lysis Buffer的配方见表四，供大家参考，抽核效果不佳时需要重点调整表面活性剂的浓度以及冰上裂解的时间。
表三组织抽核Lysis Buffer 组成
表四组织抽核Lysis Buffer配方
脑/神经组织抽核结果展示
组织抽核后的核悬液要进行质检：显微镜下观察核膜的状态（要求核膜透亮且完整）及在计数仪上统计浓度和活性(活性<5%；背景干净；核膜完整度>80%)。
脑/神经组织抽核数据分析
上一步的质检仅是通过简单的方式初步判定抽核的效果，最终数据结果的好坏及可用性需要拿到初步的数据质控报告。下图展示的是小鼠脑组织的测序结果（cellranger count），各项指标非常不错。
进一步分析测序结果中的细胞组成，主要通过测序后的cloupe文件结合已发表文献中细胞类型的经典marker定义，从结果来看各种神经细胞都存在，且占比符合预期，说明组织抽核非常成功。
以上为诺禾单细胞脑组织抽核项目经验总结，下期将为大家继续分享心肝肾等组织的项目经验，敬请期待吧！
网友评论