钩吻是著名有毒植物，是所谓“吻当挽字解牵挽人肠而绝之”，故又曰“断肠草”。传闻神农尝百草，后因误食断肠草而死。在中国的广西、广东、福建等地，有许多因误食钩吻引起消化系统、呼吸系统和神经系统中毒的报道，其中惊厥和呼吸衰竭是钩吻中毒死亡的主要原因。但钩吻的毒性作用机制一直是未解之谜，钩吻中毒后也无特效的解毒药物。因此，揭示钩吻神经毒性机制是解开钩吻中毒死亡的重要突破点。
2021年8月，Food and Chemical Toxicology（IF=6.023）杂志在线发表了来自湖南农业大学动物医学院刘兆颖教授团队题为“Phosphoproteomics reveals NMDA receptor-mediated excitotoxicity as a key signaling pathway in the toxicity of gelsenicine”的研究论文（https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278691521005408?via%3Dihub）。该研究通过磷酸化蛋白质组学、分子对接、平行反应监测（PRM）等技术手段，发现钩吻素己可结合NMDA受体，激活Ca+通道，导致兴奋性神经递质谷氨酸在突触外聚集， 从而介导NMDA受体的兴奋性毒性。该研究工作首次揭示了NMDA受体介导的兴奋性毒性是钩吻毒性作用的关键信号通路，并找到了可预防钩吻中毒死亡的药物，为进一步深入阐述钩吻毒性作用机制、应用药物克服钩吻中毒死亡的治疗方案提供了坚实基础和科学依据。
其中，中科新生命提供了磷酸化蛋白质组学、PRM验证的技术支持。
【研究材料】
小鼠脑组织
【技术方法】
磷酸化蛋白质组学、平行反应监测（PRM）、分子对接等
【研究思路】
利用磷酸化组与PRM验证，解开致命之毒断肠草的神秘面纱
研究结果
1.钩吻素己处理后不同脑区的磷酸化变化全景图
在钩吻引发小鼠中毒致死的过程中，发现伴随着抽搐、惊厥、呼吸困难等症状，故推测中毒机制与神经系统相关。进一步，利用磷酸化蛋白质组学解析机制。首先，通过观察小鼠不同中毒时期不同脑区的蛋白磷酸化变化，建立了中毒后脑部的磷酸化蛋白变化全景图谱。实验一共鉴定到17,877个磷酸化位点、4,170个蛋白，且分析不同脑区的磷酸化变化情况，发现中毒后的海马体中的蛋白磷酸化变化最大，纹状体中变化程度最小，提示中毒引发脑内磷酸化变化呈现区域性。
不同中毒时间不同脑区的磷酸化变化
2.钩吻素己影响了脑中神经信号传递过程
为了找到素己作用的关键调控机制，通过GO、KEGG等功能富集分析，发现无论在中毒后早期还是晚期，乙酰胆碱、GABA、谷氨酸等神经递质突触通路均发生显著的磷酸化变化，提示钩吻素己可能通过影响神经信号传递相关过程引发中毒。
功能与通路富集分析发现毒性作用关键信号通路
3.钩吻素己可能通过结合NMDAR等受体蛋白发挥毒性，激动剂NMDA和巴氯酚具有解毒作用
结合组学、前人研究与分析对接预测，推测钩吻素己通过直接结合α3GlyRs、GABARs 、NMDARs等受体蛋白引发相关磷酸化信号变化导致中毒。随后，采用NMDAR激动剂NMDA、GABAR激动剂巴氯酚两种药物处理，发现显著提高了中毒小鼠的存活率。进一步，采用NMDA用药后存活的小鼠样本，利用PRM方法分析了关键蛋白磷酸化变化是否恢复到健康小鼠变化特征，结果发现呈现相似模式，确证了NMDA的解毒作用。其中使用的两种药物——NMDA和巴氯酚，对未来有效解钩吻毒性的药物治疗提供了策略。
NMDA受体与钩吻毒性相关
PRM验证关键磷酸化变化（左）与磷酸化蛋白组学变化（右）趋势一致
总结
该研究通过磷酸化蛋白质组学、PRM等技术手段, 发现钩吻中毒后主要影响小鼠海马区蛋白磷酸化，神经递质释放以及受体功能，揭示了NMDA受体介导的兴奋性毒性是毒性作用关键机制，在此基础上发现的两种受体相关药物，为后续深入研究钩吻机制提供重要参考。
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