TITLE：Seasonal change is a major driver of soil resistomes at a watershed scale
译名：季节变化是流域尺度上土壤抗性变化的主要驱动因素
期刊：ISME Comuunications
日期：2021/05/12
下载链接：https://doi.org/10.1038/s43705-021-00018-y
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1 研究介绍
空间和时间变异在塑造土壤抗性组分布方面的重要究尚未深入研究。抗生素耐药性是细菌用来抵御其他生物体释放的抗生素的负面影响的一种自然现象。细菌病原体中ARG 的发生率增加和传播速度的加快已对人类、动植物健康和食品安全造成威胁。
2 研究目的
调查土壤ARG的时空动态，并评估空间和时间对塑造土壤ARG剖面的相对重要性。
3 材料与方法
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1）采样：
① 研究区位于中国东南部浙江省宁波市，83个采样点，覆盖单个流域（Zhangxi, 28.85–30.55 N, 120.92–122.27 E）；
② 采样区域土地不同利用类型：森林（天然次生林、管理林）、农田（菜地、苗圃）和果园（补充图 S1）；
③ 四个季节（春季-4月、夏季-7月、秋季-11月和冬季-1月）期间，在整个漳溪流域的城郊地区收集了319个表土样品。
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2）测序：
①引物：F515 (5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3') _R907 (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') 扩增 16S V4-V5 区域
② 高通量PCR(HT-qPCR)
3）分析：
① 所有统计分析均在 R3.6.1 环境 ( http://www.r-project.org/ ) 中进行。差异在P < 0.05 时被认为是显著的。
② 使用 Bray-Curtis 距离计算相异矩阵来确定的ARG 和细菌群落的整体模式，并使用“labdsv”和“vegan ”R包进行非度量多维尺度分析 (nMDS) 和PERMANOVA
③ 使用vegan 包进行Mantel test用于探索细菌群落和 ARGs 谱之间的关联
④ 使用季节性差异（欧几里德距离）和 ARG 和细菌群落相似性（基于 1 ̶ [布雷-柯蒂斯距离度量的差异]）之间的普通最小二乘 (OLS) 模型计算季节性衰减关系。
⑤ 使用中性社区模型(NCM)和归一化随机率(NST)确定随机和确定性过程对 ARG 组成和细菌群落组装的潜在重要性。
⑥ 使用分类随机森林(RF)分析确定了流域尺度 ARG 剖面的主要预测因子。
⑦ 使用“psych”包进行网络分析，以研究 ARG 亚型和微生物分类群之间的共现模式。
⑧ 网络图中的Cytoscape 3.7.1显现具有圆形布局算法基于强（斯皮尔曼-[R 2 > 0.6]）和显著（P < 0.001) 相关性。
⑨ 进行 OLS 回归以测试微生物分类群与年平均温度和年平均降水量之间的关系（补充表 S2）。
⑩ 所有箱线图、条形图、散点图和OLS回归均使用 R 和“ggplot2”包生成
⑪ 使用“ggpubr”和“ggsignif”包进行春季、夏季、秋季和冬季土壤 ARG 和细菌香农指数的成对 Wilcox 检验
4 结果
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图 1：土壤 ARG 和细菌群落成员的多样性和丰度。(A) 箱形图代表春季、夏季、秋、冬检测到的ARGs数量；(B)流域尺度上土壤ARGs的相对丰度；(C)箱形图代表春季、夏季、秋、冬的细菌香农指数；(D)土壤细菌群落中不同门的相对丰度。(B)和(D)图上的连续数代表了83个采样点。显著性水平如下：P<0.05，P<0.01，**P<0.001。
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图 2：土壤抗性组的空间衰减模式。( A ) 春季、( B ) 夏季、( C ) 秋季和 ( D ) 冬季的ARG 剖面相似度与采样点之间的地理距离之间的距离衰减关系。基于 1̶ [Bray-Curtis 距离度量的不同] 计算相似性。实线表示普通的最小二乘线性回归。
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图 3：土壤细菌群落的空间衰减模式。细菌群落相似性与（A）春季、（B）夏季、（C）秋季和（D）冬季采样点之间的地理距离之间的距离衰减关系。基于 1̶ [Bray-Curtis 距离度量的不同] 计算相似性。实线表示普通的最小二乘线性回归。
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图 4：随机森林模型表明不同预测因子对土壤抗性谱的重要性。计算每棵树的准确性重要性度量并在森林（5000 棵树）上取平均值。变量的 MSE（均方误差）的增加百分比用于估计这些预测变量的重要性，MSE% 值越高意味着预测变量的重要性越大。显着性水平如下：*** P < 0.001。MSE 均方误差。
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Fig. S3基于非度量多维尺度(NMDS)的(A)ARGs和(B)细菌群落丰度的季节变化(P<0.01，Bray-Curtis差异)。
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Fig .S5非度量多维尺度(NMDS)分析，利用Bray-Curtis距离描述了(A)春季、(B)夏季、(C)秋季、(D)冬季抗生素耐药性动物的地理分布；(E)春季、(F)夏季、(G)秋季、(H)冬季的细菌群落。
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Fig. S6 中性群落模型(NCM)的S6(A)Fit显示了ARG预测的发生频率相对于土壤中的相对丰度。实线表示对斯隆中性模型的最佳拟合，虚线表示模型预测周围的95%置信区间。r2表示对中性模型的拟合优度，Nm表示元群落大小乘以迁移，m值表示估计的迁移率。(B)条状图显示流域尺度上不同季节归一化随机比(NST)的比较。
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Fig. S7网络分析揭示了ARG亚型与微生物类群的共现模式。节点根据ARG类型和微生物类群进行着色。一个连接代表了一个很强的(斯皮尔曼相关系数r2>0.6)和显著的相关性(P<0.001)。边缘根据相关系数进行加权，蓝色表示负相关，红色表示正相关。节点大小根据ARGs/微生物类群的相对丰度进行加权；圆圈表示抗性基因，菱形代表细菌类群。
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Fig. S8年平均气温和年平均降水量与放线菌门、厚壁菌门和变形菌门之间的回归关系。
5 结论
目前的工作首次评估了流域尺度上 ARG 组成和丰度的时空变异性的相对重要性。我们的结果表明土壤 ARG 中的距离衰减模式具有季节性。在春季、夏季和冬季发现的显着距离衰减关系具有低适合度，表明土壤抵抗组的距离衰减模式较弱。土壤 ARG 剖面与季节性差异之间的显着负相关以及 RF 模型表明，季节性变异在塑造土壤 ARG 剖面中起着重要作用。这项研究增加了我们对土壤 ARGs 预测因子的理解，这对于预测由于环境变化和人类干扰导致的土壤 ARGs 变化至关重要。
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