Tissue-specific abundance of interferon-gamma drives regulatory T cells to restrain DC1-mediated priming of cytotoxic T cells against lung cancer

尝试做个小精读

• CTL：cytotoxic T lymphocytes 细胞毒性T淋巴细胞
• KP小鼠：Kras G12D / Trp53双敲肺癌细胞系接种小鼠
• SIINFEKL：作为多聚体刺激抗原特异性T细胞（比如强烈激活CTL的免疫应答）
• OT-1小鼠：是体内CD8+T特异性识别OVA
• Batf3 -/-小鼠：Batf3 -/-好像会导致免疫缺陷？
• tdLN：肿瘤引流淋巴结
• TIM3免疫检查点：T细胞激活的标志。

纵膈淋巴结mLN VS 腹股沟淋巴结iLN

原始CD8+ T细胞被DC1激活 ==> 变成CTL细胞

T细胞默认淋巴结产生

DC1s in mLNs prime dysfunctional CD8+ T cells against lung KP tumors

纵膈淋巴结中的DC1可以启动功能失调的CD8+T细胞在KP小鼠中发挥抗肿瘤作用

目的：CTL的启动在肺癌中如何被抑制？

分别在小鼠肺原位及侧腹接种KP肺癌细胞系，并且工程表达带ZsGreen的模型抗原SIINFEKL（荧光素酶报告基因？），养七天后检测相应tdLN中的CD8+ T活化情况。虽然在两种肿瘤中都表达了SIIN激活的T细胞，但是mLN中CD25及颗粒酶B表达量降低。iLN中T细胞免疫球蛋白（T cell immunoglobulin）及黏蛋白结构域蛋白3（mucin domain-containing protein 3，TIM3）增加。

• 这儿CD25是IL-12的Marker
• 颗粒酶B（Granzyme B,GZB）主要通过激活Caspase-3来激活细胞凋亡，是有力的细胞免疫杀伤因子，能真正反映机体免疫激活状态

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接着，通过体内启动实验（in vivo priming assay），作者接着证明了表型及功能差异与T细胞受体信号（TCR）强度无关。在mLN中，OT-1 T细胞出现了强劲的增殖，但是CD25、GzmB和TIM3的表达降低。但是这种T细胞的增殖不是SINNFEKL特异的。

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既往研究报道过交叉呈递DC1可以增强抗肿瘤免疫应答。 接

在Batf3 -/-小鼠中（DC1没有了）打肺和侧腹肿瘤，发现SIINFKEL反应性的T细胞激活严重受损。
在XCR1 DTR小鼠模型及KP-SIY肿瘤细胞中，进一步验证了DC1在mLN中启动肿瘤反应性T细胞的需求（？）。

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这儿作者还比较了一下DC2激活CD8+ T细胞的能力，最后证明是ZsG+的DC亚群能激活肿瘤T细胞，但是DC1可以促进增殖和聚集。（附图偷懒）

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纵膈tdLN中的DC1s具有高信号1，低信号2和3

DC存在不同功能状态，这些状态取决于信号1、2、3：

• 信号1：抗原（MHC？）
• 信号2：共刺激因子，CD80和CD86
• 信号3：细胞因子，IL-12

我理解就是三种因素共同反应DC细胞的状态

前文说DC1在纵膈和腹股沟淋巴结中表型不同（是不是CD25，GzmB）等等的表达不一样？

得到假设：DC1的组织特异性导致了不同的启动结果。 鉴定了ZsG+ DC1的三种信号。

解读一下这个图：就是横轴纵轴应该是不同的成分加染料。

• CD11b / CD11c
  • CD11b: 单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，NK细胞等
  • CD11c：树突细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞。（第四列筛出DC细胞）
• Ly6C：小鼠常用的单核细胞标记物？（和CD11b共同筛选单核细胞）
• CD45：在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原（leukocyte common antigen，LCA)。CD45是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义，CD45的分布可作为某些T细胞亚群的分类标志。
• MHC-II：那个什么组织复核呜啥啥的，就图里字面意思，筛出MHC II阳性的
• F4/80：F4/80是一种孤儿受体，参与细胞黏附，并可能参与专门涉及免疫系统细胞的细胞间相互作用。 它也可能在调节性T细胞（Treg）的发育中发挥作用。成熟小鼠巨噬细胞标志物。（所以第四列图筛出了非巨噬细胞的那一类，Mac = Macrophage？）
• CD103：小鼠cDC1细胞可以由组织样本以及CD8或CD103所决定，小鼠cDC2细胞可以由常见的cDC标志物和CD11b的表达来鉴别

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留一张标记表

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然后在流式上这些变化不显著，所以做了柱状图（？）。mLN中ZsG+ DC1的丰度增加，但两种tdLN的ZsG强度相似，表明DC1吞噬肿瘤碎片并迁移到纵膈tdLN的能力没有缺陷。（另外体外实验证明了两种tdLN中ZsG+ DC1激活原始CD8+ T的能力差不多，附图）

理解：ZsG强度相似说明到tdLN的肿瘤碎片差不多？

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接着应该主要是测了一下Marker？

mLN中ZsG+ DC1s的CD80和CD86表达降低，CD40表达不变。

• CD40：共刺激 B 细胞生长，参与分化和同型转换。
• CD80 / CD86：共刺激 T 细胞激活和增殖。

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mLN的ZsG+ DC1s产生更少的IL-12(图E)。

由于信号2 (CD80和CD86)和信号3 (IL-12)的低表达是未成熟dc的特征（说明iLN成熟度不高），我们检测了成熟标记物MHC-II和CCR7。两种分子都在mLN的ZsG+ DC1s上高度表达（图F）。

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前文结论
mLN中肿瘤来源的DC1高度成熟，并提供足够的信号1，但CD80、CD86和IL-12的表达减少，这是启动真正CTL所必需的。

• 一个背景：成熟的dc可以获得免疫调节分子(mregDC)，并在吞噬肿瘤碎片后抑制抗肿瘤免疫
  知道mLN里是成熟的DC1之后，研究者检测了mregDC标记物（CD40, IL-12和PD-L1），结果显示CD40的表达相似（图D），而IL-12和PD-L1在mLN的ZsG+ DC1上减少（图E, 附图偷懒)。此外，在ZsG- DC1上也检测到mLN特异性的CD80、CD86和IL-12表达下降（和图D、E一样）

不懂：这表明组织特异性的抑制不同于mregDC程序。
尝试理解：mregDC的标记物证明上调证明可以吞噬肿瘤碎片并抑制抗肿瘤免疫，但是这几个玩意在DCc1里减少，证明这种抑制不是mregDC那种的

肿瘤引流mLN中DC1s上CD80、CD86和IL-12的表达减少可能表明DC1固有的组织特异性抑制。然而，在幼稚小鼠中，DC1s信号2（CD80）和3（IL-12）的组织特异性差异不再被检测到（附图偷懒）

尝试理解：小老鼠的mLN里，组织特异性检测不到，所以组织特异性并不是DC1s的固有属性。

此外，与mLN特异性诱导体内功能障碍CD8+ T细胞相比（前一节DE），来自两个LNs的ZsG+ DC1s在离体诱导CD25和GzmB高表达的CTL（附图偷懒）。因此，mLN中CD8+ T细胞的功能失调反应并不是由DC1内在缺陷引起的，而是由DC外部的、mLN特异性的、肿瘤依赖的因子在体内抑制了CTL激活。

尝试理解：体内引起障碍，体外就高表达CTL，那说明体内的障碍不是DC1本身导致的，而是一种和肿瘤相关的，mLN里面比较特异的机制，诱导了TL激活（？）

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Treg cells can induce CD8+ T cell dysfunction and DC1 suppression

Treg细胞可诱导CD8+ T细胞功能障碍和DC1抑制

• Treg可以通过消耗CD80、CD86来抑制DC细胞的激活能力。（Treg耗竭了CD80、CD86之后就没因子激活CTL？）
• 前文说了mLN中，ZsG+ DC1的CD80和CD86都低表达。
• 提出假设：会不会是Treg耗竭这些因子？导致CD8+ T细胞的功能失调。

这儿使用FoxP3 DTR小鼠，来评估Treg对SIIN激活的CD8+ T细胞的影响。

• FoxP3对小鼠和人类的T调节(Treg)细胞谱系规范和功能很重要。Foxp3-DTR小鼠从Foxp3基因座表达敲入的人类DTR和EGFP，而不会破坏内源性Foxp3基因表达。在给予DT后，将这些小鼠用于耗尽Treg细胞。（给DT后耗竭Treg）

在耗竭Treg之后，tdLN里面的CD25和GzmB都显著增加，且在mLN中耗竭Treg后CD8+ T细胞拯救作用更大，证明Treg在mLN中的抑制功能更强。

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小结论：Treg在mLN中的肿瘤特异性T细胞应答的重塑中具有重要作用。

为了进一步证明短暂Treg的影响，在小鼠中短暂耗尽Treg（只用DT处理两天？），同样激活了mLN中的CTL启动。

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瞬时Treg耗竭也导致了ZsG+ DC1的CD80和CD86增加，但是IL-12没有增加。

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iLN也类似（附图偷懒）

小结论：Treg细胞抑制肿瘤反应性T细胞反应和DC1刺激能力，对CTL的抑制在mLN
中更有效。

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Treg cells from the tumor-draining mLN restrain cytotoxic T cell priming by suppressing DC-derived signals 2 and 3

来自肿瘤引流mLN的Treg细胞通过抑制DC衍生信号2和3抑制细胞毒性T细胞启动。

• 背景：
• 第一节中说：mLN中的CD8+ T细胞启动需要DC1s
• 第三节中说：而Treg细胞抑制CTL分化
• 假设mLN中的Treg细胞通过抑制DC1s来抑制CD8+ T细胞启动。

插个题外话
第一节说，DC1在肺里是记过功能失调的CD8+，但是不知道是不是激活CTL（应该不是）
第三节又说成熟的DC1，但是CTL激活相关的因子低表达，抑制了CTL的激活。

应用还原性体外共培养实验共培养幼稚OT-I T细胞与mLN分离的ZsG+ DC1s和Treg细胞。在低Treg:OT-I T细胞比例时，Treg细胞导致OT-I T细胞上CD25和GzmB表达显著降低，而CD8+ T细胞增殖仅轻度降低。

理解一下：这个图里应该就是全是low ratio的，然后B是加ZsG+ DC1，C是加共刺激因子（抗CD3/28）然后出来的CD8+ T细胞没少多少，但是CD25和GzmB降低说明功能受损

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这种CD25低，GzmB低的表型不就是第一节中的那种功能障碍的CD8+ T细胞吗？

为了测试Treg细胞是否需要DC1s来诱导功能失调的CD8+ T细胞，我们使用抗(a)CD3和aCD28来刺激OT-I T细胞（一个加DC1，一个CD3/28来刺激）。结果是在没有DC1s的情况下，相同数量的Treg细胞对OT-I T细胞上CD25和GzmB表达的影响就变小了。

小结论：

• 前文说DC1介导了功能失调的CD8+ T细胞
• Treg细胞可以通过耗竭CD80/86将DC1介导的CTL启动重定向为功能失调的类群，但这种抑制需要DC1s的存在。

附图偷懒环节
为了确定体外共培养的CD8+ T细胞状态和第一节中的体内启动试验在表型标记（低CD25及GzmB）之外是否具有可比性，我们对体外启动的T细胞进行了单细胞RNA测序，并分析了在存在或不存在Treg细胞的情况下，由DC1s启动的CD8+ T细胞之间的差异表达基因

• Treg细胞的存在导致GzmB、Il2ra、Il12rb1和Il12rb2表达减少（与效应因子功能相关的转录本），并导致CD8+ T细胞上与抑制效应T细胞分化（Sell、Pecam1、Lef1、Tcf7I、S1pr1、S1pr4）和T细胞命运决定（Klf2、Klf3）相关的转录本表达增加

在存在或不存在Treg细胞的情况下，体外T细胞实验的转录谱分别与已知的mLN或iLN的RNA测序一致。

小结论：因为不管是体外还是体内，这种表达的情况是一致的，说明T细胞的这种启动是保守的。

接着呢，作者就评估了一下mLN和iLN中的Treg的一个抑制能力，然后就发现体外培养中的Treg也是抑制了CD8+ T细胞CD25和GzmB的表达。这和表达的情况是一致的。同时mLN里的更厉害一点。

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另外，Treg细胞固有抑制能力的组织特异性差异仅在DC1+Treg+OT-I T细胞共培养中被检测到，因为基于aCD3/ acd28的共培养显示出类似的抑制（附图偷懒）。

为了比较mLN和iLN Treg细胞在受控环境下的DC抑制效果，我们建立了来自p40-IRES-eYFP IL-12报告小鼠骨髓的成熟骨髓来源的DC （BMDC）和来自mLN和iLN的Treg细胞的共培养。

• 省流：这个小鼠就是报告IL-12的，之前那个应该是一个报告基因元件？

与前文结果一致， mLN和iLN的Treg细胞都抑制了BM-DC上CD80和CD86的表达，另外，mLN Treg细胞更有效地抑制CD80和CD86的表达。

小理解：前文一个是KP鼠，一个是Treg耗竭鼠，这儿是整出来共培养。

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但是，iLN来源耳朵TregTreg细胞诱导IL-12抑制比mLN是更强的(图4K)，这与第二节中的情况是相反的（体内应该是MLN抑制更强）。

小解释：这种差异可以解释为在本实验中缺乏效应T细胞，因为T细胞衍生的IFN-g诱导IL-12表达。

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背景：DC来源的刺激信号不足会阻止CTL产生。
前文说Treg通过抑制DC1产生的信号2和3来引起mLN中CD8+ T细胞的功能异常。那么补充信号2和3是不是可以真就CTL的产生？

体外：然后就体外进行ZsG+ DC1+Treg+OT-I T细胞共培养，分别加抗CD28和IL-12。结果发现加了抗CD28和IL-12可以让CDC25和GzmB部分高表达（CTL部分恢复）。然后同时加俩可以让CTL完全恢复。
体内：接着在荷瘤小鼠的mLN中评估CD8+ T细胞的启动情况，也是加抗CD28和IL-12，然后发现也是CD25和GzmB表达增加

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小总结：在mLN中，Treg细胞对DC1产生的刺激信号（2&3）的抑制增强，导致CD8+ T细胞出现功能失调（不当CTL了）。

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Treg cells suppress CD8+ T cell priming in the mLN via direct interaction with DC1s

Treg细胞通过直接与DC1s相互作用抑制mLN中的CD8+ T细胞引物。

一个背景知识：Treg细胞能以接触依赖或非接触依赖的方式抑制DC刺激分子。为了首先评估CD8+ T细胞启动过程中Treg细胞和DC1s的空间排列，我们对过继移植CD45.1+ OT-I T细胞后的XCR1 DRT小鼠中的mLN及iLN进行了免疫荧光（IF）染色。(图5A)。

• 这是个什么鬼小鼠：XCR1 DTR小鼠
• DTR 小鼠是通过基因编辑让目的细胞表达白喉毒素受体（Diphtheria toxin receptor，简称DTR），然后通过注射白喉毒素（Diphtheriatoxin，简称DT）实现细胞的条件性剔除。
• XCR1+交叉呈递DC1细胞

这个坑回头看心情填不填吧

分别使用内源性Venus信号、CD45.1和FoxP3标记鉴定了XCR1+ DC1s、肿瘤反应性OT-I T细胞和Treg细胞。我们将分析重点放在OT-I T细胞微孔上。（定义：包含至少一个DC1的OT-I T细胞簇为中心的圆形区域）

我说婷婷：就是大概就是Treg和DC1作用在CD8+ T细胞上，那么就是以T细胞为中心，看看Treg和DC1到他的距离。

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评估指标：测量Treg细胞到其最近的DC1的距离来评估Treg和DC1的接近性。
结果：mLN中微池相关的Treg细胞和DC1s彼此更接近（图5B, 5C）。在mLN中，Treg细胞和DC1s的这种空间接近是微孔特异性效应，因为在微孔外，Treg和DC1的距离增加了（图5C）。mLN和iLN中的微孔大小相似，mLN中微孔内Treg和DC1的比例也没有增加（图5D）。
（量没变多，但是距离近了）

小结论：mLN中Treg细胞抑制的增加可能是由Treg细胞和参与肿瘤特异性CD8+ T细胞激活的DC1s的物理接近所驱动的。（就是靠得近所以产生作用）

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靠得近就起作用，那是不是要靠在一起捏？
为了测试Treg细胞介导的DC1s抑制是否需要直接的细胞接触，文章阻止了两种细胞之间MHC-II依赖性的相互作用。抗体介导的MHC-II在体外ZsG+ DC1:Treg:OT-I T细胞共培养中完全逆转了Treg细胞抑制表型，这表明DC1s上的MHC-II可达性对于Treg细胞介导的CD8+ T细胞启动抑制至关重要。

小理解：就是用MHC-II抗体分子给进去，就会逆转Treg的抑制作用。就是DC1上的MHC-II和Treg相互作用引起抑制。

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为了测试MHC-II消融对体内DC1刺激能力的影响，我们生成了WT:H2-Ab1 -/- 混合骨髓嵌合体（BMC）（两种都有），并比较了mLN中野生型（WT）和H2-Ab1 -/- ZsG+ DC1s的表型(图5G, S2L和S2M)。MHC-II缺失导致体内ZsG+ DC1s上CD80、CD86和IL12的表达增加.

• H2-Ab1：MHC II特征基因

小理解：敲掉特征基因，MHC-II表达不行了，那么就不抑制了，然后T细胞激活的几个因子就增加。

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小结论：Treg细胞介导的抑制作用是通过MHC-II依赖的相互作用传递给DC1s的。

接着这种DC1特异性的MHC-II缺失对CD8+ T细胞的启动有什么影响呢？

我们生成了

• WT
• Batf3 -/- : WT
• Batf3 -/- : H2-Ab1-/- 混合骨髓细胞

以比较MHC-II+ DC1s（在WT和Batf3 -/- : WT骨髓细胞中）和MHC-II - DC1s （在Batf3-/- : H2-Ab1 -/- 骨髓细胞中）对CD8+ T细胞启动的影响。

-Batf3：缺乏Batf3表达作用的T细胞能够正常增殖和分化，但随后数量急剧下降，记忆反应减弱。反之亦然，BATF3的过度表达延长了了CD8+ T细胞的存活时间并促进了它们向记忆的转变。这是由于在信号通路当中，BATF3通过促凋亡因子BIM调控着T细胞的凋亡和存活。而如果能够对这一机理加以应用，那么就可以对CD8+T细胞的存活和记忆进行编程和修饰，从而延长这一肿瘤免疫关键细胞的作用时间，使肿瘤免疫反应能够抵御未来的威胁。

Batf3 -/- : H2-Ab1 -/- BMC中DC1特异性MHC-II缺失与对照BMC相比恢复了mLN中CTL的启动(图5K)。(缺MHC-II可以逆转CTL的生成)

我们使用XCR DTR : WT和XCR DTR : H2Ab1-/-混合BMC中也独立验证了这一结果。（加DT去除DC1之后，也可以逆转这种功能（DC1特异性MHC-II缺失可以导致mLN中CTL的有效启动）。

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小结论：因此，在肺肿瘤中，MHC-II 依赖的Treg:DC1相互作用导致DC1抑制和相关的CD8+ T细胞功能障碍。
（主要证明了MHC-II的依赖）

（累死）

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Th1-like Treg cells expand in tumor-draining mLNs

Th1样Treg细胞在mLN中扩增。

前文感觉已经讲了讲DC1和Treg细胞大概是咋样去抑制CTL的出现以及功能失调CD8+ T细胞如何产出。但是，目前尚不清楚是什么组织特异性因素导致Treg细胞在mLN中比iLN中更具有抑制作用。
等于现在是要比较一下mLN和iLN之间的一个情况了。

背景：抑制的增加通常与Treg细胞丰度增加相关

所以首先作者比较了mLN和iLN中的Treg细胞量，没啥差异

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另外，SIIN反应性CD8+ / Treg细胞比率与mLN中观察到的抑制增加无关（附图偷懒）。

小背景：Treg细胞是异质的，具有不同的组织特异性功能特化和TCR库，这可能影响它们的抑制能力。

所以感觉就是想看是不是这种组织异质性导致了Treg在mLN中得抑制增加。

为了表征它们的转录状态，我们对从荷瘤小鼠和naive小鼠的mLN和iLN中分选出来的Treg细胞配对进行了scRNA-seqT细胞受体测序（TCR-seq）。

小结果：

• 我们获得了16,249个Treg细胞的高质量转录组，并从55.4%的细胞中恢复（recovered？）了TCR-β序列，从23.1%的细胞中恢复了TCR-α序列，从14.4%的细胞中恢复了TCR-β和TCR-α配对序列。（附图偷懒）
• 最初的无监督分析确定了四簇Treg细胞，我们随后重点分析了三簇活化的Treg细胞，这些细胞表现出与naive T细胞相关的标记和基因集表达减少。

在被激活的Treg细胞中，我们发现了四个簇：

• 富集与早期激活相关的转录本的Treg细胞（Nr4a1, Egr1, Egr2, Myc, Dusp）
• 富集与早期增殖相关的转录本的Treg细胞（Mki67, Top2a, Stmn1, Cenpf, Birc5）
• 两个被激活的Treg细胞簇
  • 激活簇1（C1）：Cxcr3, Icos, Tigit, Prdm1, Ctla4
  • 激活簇2（C2）：Rorc, Ccr6, Il10ra, Il18r1, Tgfbr2

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与原始LN相比，活化的C1在两种tdLN中都显著富集，这表明该转录程序是对肿瘤的反应（附图偷懒）。

背景：Treg细胞可以以抗原特异性的方式抑制，并在对肿瘤的反应中进行克隆扩增。

我们评估了它们的克隆扩增。Treg细胞在两种tdLN中均有克隆扩增，但在两种naive LNs中均无克隆扩增。mLN和iLN的整体克隆扩增程度相当，且这种扩增仅限于活化的C1 Treg细胞簇。

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以下为附图偷懒时间

为了评估Treg细胞的特异性（C1簇活化），我们分析了活化的C1 Treg细胞中的CDR3序列。

• CDR3：由V(D)J结编码的序列称为互补决定区域3或CDR3。这个序列在α链和β链中都具有最高的可变性（variability），决定了T细胞识别MHC分子所呈现的抗原肽的能力。

多个小鼠的Treg细胞中独立恢复了四个公共TCR-β序列，这个序列在mLN和iLN中共享。这些序列由不同的核苷酸重排形成，证明了TCR序列的收敛性。同时与其他CDR3-β序列相比，这些序列更有可能表现出克隆扩增，并且在naive iLN或mLN中完全不存在，尽管序列恢复程度相当。

小结论：这里分析的Treg细胞对两种tdLN中存在的肿瘤相关抗原有反应。虽然这些数据并不排除TCR保留序列差异可能影响Treg细胞抑制能力的可能性，但他们认为TCR以外的特征可能在调节Treg细胞抑制功能方面起主导作用。

激活的C1 Treg细胞的表型与功能抑制能力的增加相关，那么mLN和iLN中的C1 Treg细胞之间的转录是否有差异？

分析了一下

• mLN中激活的C1 Treg细胞的转录本，可以发现其中激活的基因有：
  • 免疫抑制相关：Nrp1, Fgl2和Nt5e
  • IFN反应和Th1极化相关：Ifngr1, Cxcr3, Tbx21, Cybb和Ptpn11
• iLN富集的转录本有：
  • T细胞激活相关：Icos和Gcnt1
  • Treg细胞存活和稳定性相关：Cd2和Satb1。

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由于Th2样Treg细胞可以有效抑制抗肿瘤免疫（那这种C1型的Treg会不会是Th2样的呢？），作者检测了典型的Th1-、Th2-和TH17-极化转录因子（Tbx21、Gata3和Rorc）在活化的C1 Treg细胞上的表达。在所有mLN中，Tbx21表达一致增加，而Gata3和Rorc表达相似（附图偷懒）。

小结论：激活的c1 Treg细胞在肿瘤引流mLN中Th1极化。

两种tdLN中Treg细胞的进一步流式结果显示

• 来自mLN的Treg细胞上天然Treg细胞标记物neuro-pilin 1 （NRP1）和Helios增加
• PD-1和CTLA-4的表达增加(图6I, 6J, S4A和S4B)。
• 抑制分子NRP1、CTLA-4、CD39和CD73在mLN Treg细胞上差异表达
• 转化生长因子β-1（TGF-β1）和CD25在iLN Treg细胞上高表达

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小结论：说明啥呢？说明两种tdLN的抑制模式存在一些不同。

继续观察结果：

• Ki67和FoxP3表达相似。
• 与scRNA-seq结果一致，Th1样标记CXCR3和T-bet在mLN Treg细胞上有差异表达(图6K)。
• 对T-bet、Gata3和RORgt表达的分析证实了Th1极化，与iLN相比，mLN中T-bet在大批量的测序和CD44+ CD62L效应Treg（eTreg）细胞上表达最高，并且T-bet+ CXCR3+ Th1样eTreg细胞在mLN中的频率增加。

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小结论：mLN中的Treg细胞获得了一种Th1样效应表型，富集在一组不同的抑制分子中。

前文说了Treg细胞直接与mLN中的DC1s相互作用，那么久要看DC1s是否调节Treg细胞的反应。在WT和Batf3-/-小鼠中，Treg细胞表达PD-1和CTLA-4相似，但在没有DC1s的情况下，T-bet降低，T-bet+ CXCR3+ th1样eTreg细胞的频率降低。因此，mLN中eTreg细胞的Th1极化需要DC1s。（附图偷懒）

前文发现，与iLN相比，IFN调控的转录物和蛋白质优先在mLN的Treg细胞上表达，我们假设IFN在mLN中诱导Th1样Treg细胞的生成。

我们使用WT：Ifnar1-/-、WT：Ifngr1-/-和WT：Ifngr1-/-Ifnar1-/- 混合共培养的BMC，来比较mLN中WT和IFN受体缺失 Treg细胞的表型。虽然Ifnar1的缺失导致T-bet的适度降低，对Treg细胞上CXCR3的表达没有影响，但Ifngr1的缺失导致T-bet和CXCR3表达的严重降低，与已发表的数据一致。

尽管FoxP3、CD25、PD-1、CTLA-4和CD73的表达不受IFN受体缺失的影响，但在mLN中Ifngr1缺陷的Treg细胞上，CD39表达降低（附图偷懒）。Th1标记物和CD39在Treg细胞上的表达很大程度上依赖于肿瘤引流mLN中IFN-g的感知。

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然后，我们测试了Th1样eTreg细胞的诱导是否同样依赖于两种tdLN中的IFN感应。我们生成了FoxP3 DTR.eGFP：Ifnar1-/-，FoxP3 DTR.eGFP：Ifngr1-/-， FoxP3 DTR.eGFP：Ifngr1-/-Ifnar1-/- 混合BMC，并比较mLN和iLN中供体来源的WT和IFN受体缺陷（KO）eTreg细胞的表型。

这些BMC使我们能够排除宿主来源的Treg细胞（WT），并验证这些抗辐射细胞没有混淆我们的分析。与之前对整体的Treg细胞的分析一致（上图B），T-bet和CXCR3在mLN中的eTreg细胞表达依赖于IFN-γ感知。同样，Ifngr1的敲除使iLN中eTreg细胞上的T-bet和CXCR3表达变少（？）。尽管T-bet+ CXCR3+ th1样eTreg细胞优先富集于mLN的WT免疫部分，当Ifngr被敲除时，它们的表达在mLN和iLN之间是相当的。因此，Th1样eTreg细胞程序在两种LNs中都依赖于IFN-γ，但它主要是在mLN的Treg细胞中诱导的。（附图偷懒）

由于Th1样eTreg细胞的诱导依赖于IFN-γ的感应，我们假设mLN特异性富集在Th1样eTreg细胞中可能是由于IFN-γ丰度的组织特异性差异造成的。事实上，与iLN相比，肿瘤引流mLN中IFN-g的含量增加了3.78倍-。相比之下，两中tdLN之间IL-2丰度基本相似（附图偷懒）。

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此外，来自naive LNs的IFN-γ测量结果与来自tdLN的IFN-γ测量结果一致，在naive小鼠中，与匹配的iLN相比，mLN中的IFN-γ更丰富。

mLN特异性的IFN-γ富集与肿瘤本身无关，由LN的解剖位置决定。由于肺微生物依赖的IFN信号可以影响肺特异性免疫，我们测试了IFN-g的组织特异性差异是否会在无菌（GF）小鼠中维持。与无特异性病原体（SPF）小鼠不同，naive GF小鼠的mLN和匹配iln中IFN-g的量是相等的。因此，观察到的IFN-γ的mLN特异性丰度是由共生细菌的存在引起的

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mLN-specific enrichment in IFN-g drives induction of Th1-like Treg cells and the associated dysfunctional T cell responses against lung cancer

IFN-g中的mLN特异性富集驱动Th1样Treg细胞的诱导和相关的功能失调T细胞对肺癌的反应。

背景：前文研究说了mLN中的Treg细胞表达趋化因子受体CXCR3，既往研究又说了CXCR3指导效应T细胞在淋巴结内定位，并促进与DC的相互作用。

所以就想看CXCR3在功能上是否对Treg细胞抑制肺肿瘤的CTL反应是必需的

我们生成了FoxP3 DTR：WT和FoxP3 DTR：CXCR3 -/- 混合BMC。用来比较CXCR3缺陷Treg细胞（FoxP3 DTR：CXCR3 -/- BMC）和WT Treg细胞（FoxP3 DTR：WT BMC）对CD8+ T细胞启动的抑制作用。
结果显示：Treg细胞特异性缺失CXCR3对肿瘤引流mLN中的CD8+ T细胞表型没有影响，这表明几种冗余的趋化因子受体/配体通路可能促进Treg:DC通信。（不止CXCR3影响通信）

前文作者发现：IFN-γ细胞因子和IFN-γ依赖的Th1样Treg细胞在mLN中富集
这儿就想测试IFN-γ感知是否可以调节Treg细胞抑制CTL启动的能力。

本文生成了FoxP3 DTR：WT和FoxP3 DTR：Ifngr1 -/- 混合BMC，以评估Ifngr1缺陷的Treg细胞（FoxP3 DTR：Ifngr1 -/- BMC）或WT Treg细胞（FoxP3 DTR：WT BMC）对mLN中CD8+ T细胞启动的影响。

小结果：与对照组相比，Treg细胞上的Ifngr1消融导致mLN中引物的CD8+ T细胞上CD25表达增加。这2.24倍的增加（±0.374 SEM）与前文中（最前面一张图，吐了）iLN-和mLN-引物T细胞之间CD25表达的3.32倍差异（±0.947 SEM）相当。

尽管GzmB和TIM3/TCF1的表达没有变化(图7I和S6H)，但部分挽救也是很好的，因为FoxP3 DTR:Ifngr1 -/- bmc中大约一半的免疫细胞存在Ifngr1缺失，包括DC1s，它依赖于IFN-g产生IL-12。在没有DT处理的情况下，在FoxP3 DTR：WT和FoxP3 DTR：Ifngr1-/- BMC的mLN中启动的CD8+ T细胞表现出不变的CD25表达，说明这种拯救效果是由Treg细胞特异性的IFN-γ感知消融所驱动的。

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然后，我们评估了抗体介导的IFN-γ阻断是否可以对抗mLN中富含IFN-γ的环境，并重新连接Treg细胞极化和CD8+ T细胞启动。

IFN-γ介导CTL抑制，那么阻断IFN-γ能不能抑制启动？

既往研究报道了IFN-γ在CD8+ T细胞效应分化中发挥重要作用，我们在肿瘤植入后早期使用IFN-γ阻断剂（不让在mLN中产生），并评估过继转移T细胞的启动作用（给T细胞看能不能激活）。IFN-γ阻断导致肿瘤引流mLN中OT-I T细胞CD25、GzmB和TIM-3表达增加，但对iLN无影响，说明这种免疫调节是组织特异性的。

IFN-g阻断导致mLN和iLN Treg细胞中T-bet表达降低，而Treg细胞总数保持不变。短暂的IFN-g阻断足以挽救CTL启动，并改变肿瘤引流mLN中富含IFN-g环境中的Treg细胞表型。

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• T-bet：TBX21编码了一个重要的免疫转录因子（T-bet）。自从2000年被Laurie H. Glimcher组发现以来，T-bet转录因子被广泛的研究。T-bet是调控1型辅助T细胞 （TH1）的最重要的转录因子。后来，T-bet被发现也在先天免疫系统 (innate immunity)和先天样淋巴细胞(innate-like adaptive lymphocytes)起到关键作用。

为了研究IFN依赖性Th1样Treg细胞是否与人类抗肿瘤免疫减弱相关，我们重新分析了来自人类黑色素瘤的肿瘤浸润T细胞的scRNA-seq数据集。在这些患者中，IFN反应程序和TBX21或CXCR3转录本的9Treg细胞表达与ICB耐药密切相关。

CD8+ /Treg细胞比例与ICB反应无关，这表明Treg细胞的质量而不是数量决定了抗肿瘤免疫的结果。结合我们发表的肺癌特异性CD8+ T细胞功能障碍导致ICB耐药的发现，这些数据表明IFN-γTreg细胞与人类和小鼠的ICB耐药相关。

小结一下

没啥想说的，免疫文章太难了。、