详细参考路径为：https://www.dna-asmdb.com/tools/batmeth2-tutorial/bt2-pipeline.html

https://batmeth2-docs.readthedocs.io/en/latest/function/PlotMeth.html

BatMeth2软件介绍：

Batmeth2是一款操作简便的亚硫酸氢盐测序（BS-Seq）分析流程工具包，它可以在允许不同长度插入缺失（Indel）情况下准确地完成亚硫酸测序序列比对。为了方便DNA甲基化数据分析，BatMeth2可以从raw reads测序数据比对到数据可视化、并最后生成HTML可视化报告文件。

相关功能包括：

亚硫酸氢盐测序数据比对；

甲基化水平计算，包括单碱基水平的甲基化水平、基因组区域或者基因转座子等功能区域的甲基化水平；

差异甲基化胞嘧啶/区域（DMC/DMR）检测功能；

甲基化水平可视化。

这些功能可以作为一个全流程使用，也可以分步单独运行，非常有利于亚硫酸氢盐数据分析。

BatMeth2 安装

一、安装要求

GCC(v4.8)，GSL

SAMtools（建议>1.3.1版本）

Fastp，如果将原始数据做为输入文件，需要这个软件，否则不必

Fastp下载：wget http://opengene.org/fastp/fastp

Fastp权限更改: chmod 744 fastp

二、安装Batmeth2的过程

下载软件安装包BatMeth2-master.zip（https://github.com/GuoliangLi-HZAU/BatMeth2）

解压软件安装包BatMeth2-master.zip

将解压后的软件目录“BatMeth2-master”修改为“BatMeth2”

安装过程

cd BatMeth2

./configure

make

make copy

如果不需要gzip格式的进程文件，你可以使用以下过程安装软件：

cd BatMeth2

./configure

make nogzip

make copy-nogzip

BatMeth2的二进制文件将创建于bin目录下

BatMeth2 分析流程

为了更方便地完成DNA甲基化数据分析，我们打包了所有功能，以完成易于使用的自动运行包，用于DNA甲基化分析。在执行BatMeth2期间，会生成有关样本统计信息的html报告。

在进行数据分析前，需要准备基因组和索引文件

首先准备fasta格式的参考基因组

对于WGBS数据，建立索引：

BatMeth2 index -g GENOME.fa

对于RRBS数据，建立索引：

BatMeth2 index_rrbs -g GENOME.fa

数据分析

对于原始数据，运行命令

###### COMMANDBatMeth2 pipel --fastp ~/location/to/fastp -1 Raw_reads_1.fq.gz -2 Raw_read_2.fq.gz -g ./batmeth2index/genome.fa -o meth -p 6 --gff ./gene.gff

经过质量过滤后的数据，运行命令：

###### COMMANDBatMeth2 pipel -1 Clean_reads_1.fq.gz -2 Clean_read_2.fq.gz -g ./batmeth2index/genome.fa -o meth -p 6 --gff ./gene.gff

BatMeth2 分析流程主要包含：测序序列质量过滤、DNA甲基化序列比对、DNA甲基化水平计算、DNA甲基化水平功能注释以及DNA甲基化水平可视化等功能。

主要参数如下：

数据质量控制

--fastp fastp程序路径， 如果未指定--fastp参数，输入文件应该使用质控后的数据

序列比对

--aligner 指定比对程序，默认BatMeth2，可选程序bwa-meth, bsmap, bismark2, no(输出目录下已有比对结果文件)

必要参数

-i  输入文件，如果是双端数据，请使用-1, -2参数，输入文件可以使用逗号分隔

-1  输入文件左端的文件，如果是单端请使用-i参数

-2  输入文件右端的文件

-g  比对使用的参考基因组路径

-p  线程数，默认6

-O  输出结果目录，默认是输出到当前目录下（./）

-o  输出文件的前缀

选用其他比对软件时：

--go 选用其他比对软件（bsmap/bwa-meth/bismark）进行比对时，需指定该软件对应的基因组索引文件

计算甲基化水平

--Qual      当read质量分数>=Q，用于甲基化水平分析,默认是10

--redup      去除PCR冗余，0或者1，默认是0.

--region    设置计算甲基化水平区间大小，可用于后续差异分析，默认参数是1000bp。

-f          对于sam格式输出文件，包含methState属性。[0或者1]，默认为0

--coverage  设置最小的覆盖度，默认是5

--binCover  每个区域最小的nCs，默认是3

--chromstep  染色体使用100000bp的重叠滑动窗口，步长为50000bp。 默认为：50000（bp）

DNA甲基化功能注释

--gtf/--gff/--bed  Gtf文件，gff文件或者bed文件

--distance        分布于基因bocy和上下游的DNA甲基化水平。设置上游和下游的距离，默认是2000bp

--step            基因及其两侧序列使用序列长度的5%的重叠滑动窗口，步长为序列长度的2.5%，默认步长为0.025（2.5%）

-C                测序覆盖度不能超过该数值，默认是1000

--coverage        设置最小的覆盖度，默认是5

--binCover        每个区域最小的nCs，默认是3