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Article title：Transcriptomic and Metabolomic Analyses Provide Insights into the Upregulation of Fatty Acid and Phospholipid Metabolism in Tomato Fruit under Drought Stress

期刊：Agricultural and Food Chemistry

发表时间：2021

通讯作者：Tomiko Asakura

摘要

在这个研究中，干旱的胁迫条件促进了番茄（Solanum lycopersicum）中脂肪酸的生物合成以及促进了番茄果实中的脂肪酸（fatty acid）含量的积累，并且在这个过程中一些由棕榈酸（palmitic acid）和油酸（oleic acid）组成的磷脂（phospholipids）也发生了显著的积累，特别是在种子中。此外，细胞壁和细胞膜中的肌醇也有所增加。在成熟的果实中，β-丙氨酸和4-氨基丁酸等代谢调节因子水平升高。 这些结果都显示这些组分都与干旱先攻有关，有助于提高干旱条件下的忍耐性以及可以提高后续的番茄果实的营养价值和健康益处。

前言

番茄在全世界消耗量最大的蔬菜作物之一。各种各样的西红柿被广泛的用于不同的食品加工过程。对于生吃的番茄（tomato fruits consumed raw）来说，颜色、口感和质地等都是人们主要的关注点。近年来，育种家一直通过杂交来培育新品种，以提高消费者在口味和质地等方面的适口性（palatability）。除了培育具有理想性状的家系外，还可以调整（tailored）栽培方法来提高营养价值和适口性。栽培条例例如温度、光照、肥沃度等都影响了果实的成分组成，在其他的一些蔬菜作物里，已经有相关的研究证明一些栽培条件的改变会引起植物中代谢的改变，从而影响果实的糖分含量、氨基酸含量等。在干旱条件下，植物往往会减少能量的合成和抑制糖酵解（suppress glycolysis）来抵御水分的胁迫。人们对于干旱胁迫的反应的研究主要集中在源器官例如根中，而在汇（sink）器官中的研究还非常的少。

在遭受盐胁迫或干旱胁迫的番茄植株中，果实中次级代谢产物，如番茄红素、多酚和维生素的产生也会发生变化。这些化合物水平的变化已通过代谢组分析得到广泛检测。然而，除了已经关注的化合物外，我们几乎没有关于哪些化合物在干旱胁迫下增加/减少的信息。 此外与提高抗寒性有关的生理活性成分的产生所涉及的代谢途径仍然难以捉摸。为了解决这个问题，作者进行了转录组和代谢组的联合分析。果实中许多与合成相关的基因在绿色成熟期表达上调。为了调查果实在应对干旱胁迫时的基因表达和化合物生产之间的变化，作者对成熟绿果进行了转录组分析，然后对成熟红果进行了代谢组分析。作者的研究提供了对干旱条件下番茄果实的味道质量和功能成分的深入了解，并为蔬菜作物的生产和加工提供了更全面的考虑

from the standpoint 从这个角度来看                                                          clay 粘土

soaked with 用...浸泡                                                                                 Liquid fertilizer 液体肥料

was sowed in a groove about 1 cm deep 播种在约1cm的槽中                  dilute 稀释

suspended 暂停                                                                                         impurities 杂质

agarose gel electrophoresis 琼脂糖凝胶电泳                                          comprehensivelyexamine 全面检查

desaturase 去饱和酶                            synthase 合成酶                          reductase 还原酶

saturated/unsaturated 饱和/不饱和                                                           jasmonate 茉莉酮酸酯

材料和方法

材料

种子获取于National BioResource Project (NBRP) at the 筑波大学基因实验中心, 是在温室（25 °C for 12 h during the day and 20 °C for 12 h at night）中培育。在后续的培养中，在开花后对照组每天都浇液体肥料水，而处理组则每七天浇一次。果实大约在开花后30天达到成熟的绿色阶段，在开花后40天左右达到成熟的红色阶段。使用液氮取样，并立即放入-80℃保存。

DNA微列阵分析（ DNA Microarray Analysis）

技术认识：关于微列阵芯片、RNA-seq和转录组测序的关系。

转录组代表存在于细胞中RNA的全部类型，包括mRNA、rRNA、tRNA以及其它各种非编码RNA等。微阵列（Microarray）和RNA-seq（RNA sequencing）是转录组分析中的两种主要技术。它们的主要区别在于，微阵列基于预先设计的标记探针与目标cDNA序列的杂交，而RNA-seq通过测序技术对cDNA链进行直接测序。

微阵列取决于杂交探针，根据杂交信号强度定量基因相对表达水平。（首先从样品中提取总RNA，然后构建cDNA文库。将cDNA与预先设计的带荧光标记的DNA探针在固体表面（spot matrix）混合，互补序列将与微阵列中的标记探针杂交。通过检测微阵列的探针荧光强度，这些探针代表了不同的基因，可获得各基因的相对表达谱。该技术的准确性取决于所设计的探针，已知序列的碱基组成以及探针杂交的亲和力，因此具有局限性）

RNA-seq是一种快速且高通量的方法，不依赖于预先设计的探针或已知的序列碱基特征，因此具有较高的灵敏度和检测新基因以及遗传变异的能力。（首先提取总RNA并在纯化后片段化处理，然后构建cDNA文库，使用高通量测序的方法对cDNA进行测序。获得测序序列后比对到参考基因组上（或者从头组装转录本后再比对），根据测序序列的覆盖情况定量基因表达。理论上，如果测序深度足够深，则可以覆盖到所有基因，包括尚未发现的新基因，并能实现全长基因水平的定量。并且RNA-seq本身是一种测序技术，能获得基因的碱基组成信息，因此除了用于定量基因表达外，还可用于基因组结构研究，这是微阵列芯片无法比拟的。但是高通量的方法存在一定的假阳性问题是不可忽视的）

作者在这个研究中是使用了基因芯片技术来测定基因的表达情况，后续对表达数据进行了注释、差异分析、富集分析等。并且作者还进行了荧光定量实验进行验证。

代谢组分析

主要的步骤就是样品准备（使用的是冻存样），对样品处理后就进行了衍生化（Derivatization），然后介绍了GC-MS/MS（气相色谱-质谱联用）的一些参数，最后就是下机数据的分析介绍。

结果

转录组分析

因为不同mRNA水平有助于成熟果实中成分的生物合成，所以作者全面的测定了番茄果实成熟的绿色时期分别在正常条件下（C）和在干旱胁迫条件（S）下的mRNA表达水平。差异表达基因的PCA结果显示对照组和处理组表现出了很好的分组状况。在这个基础上，作者进行了GO富集分析，并且比较了差异表达基因的表达水平。

1、通过GO富集分析对差异表达基因（DEGs）分类

通过分析，一共有31个terms被富集到，这31个terms被分为4个组，分别是细胞壁代谢（cell wall metabolism）、脂肪酸代谢（fatty acid metabolism）、果实成熟相关（fruit maturation related）和疾病响应相关（disease response related）。之后作者是专门针对细胞壁代谢和脂肪酸代谢相关的差异基因进行了比较（胁迫组和对照组）

2、基因表达水平的比较

细胞壁相关的差异基因一共有18个，在胁迫组中有11个表达下调，7个表达上调。其中编码与果胶生产相关的酶例如果胶酯酶（pectin esterase (PME)）和果胶裂解酶18（pectate lyase 18）出现了下调。其蛋白产物能合成肌醇的肌醇单磷酸酶1（myo-inositol monophosphatase 1（IMP））同样也出现了下调。相反的是，编码催化相反的过程的酶的基因UDP-galactose:myo-inositol D-galactosyltransferase (Gols)出现了上调。此外，参与细胞壁木葡聚糖分子的移位和裂解的XTH6和XTH16出现了上调，而XTH3, XTH7, and XTH32出现了下调。作者同样也通过热图对脂肪酸代谢相关的差异基因做了这样的比较。发现在干旱胁迫的条件下，酰基-[酰基载体蛋白]去饱和酶（Acyl-ACP desaturase）、3-氧酰基-[酰基载体蛋白]合酶I（FabB）、烯醇-[酰基载体蛋白]还原酶（FabI）发生了上调。此外，编码与饱和/不饱和脂肪酸生物合成的最后步骤相关的酶的基因油酰基酰基载体蛋白硫酯酶、叶绿体（FatA）也发生了上调。相反的是与茉莉酮酸酯生物合成的基因脂氧合酶和烯氧合酶（AOS）发生了下调。

为了验证微列阵（基因芯片）数据的准确性，作者对具有不同表达水平的基因进行了qRT-PCR验证。结果表明在脂肪酸合成方面，编码FabI, FabB, FatA，Acyl-ACP 去饱和酶的基因在胁迫组的表达水平要高于对照组。这些结果都支持脂肪酸合成会上调的预测。

在细胞壁代谢方面，编码PME的基因在干旱条件下要比对照条件下的表达水平下调0.1倍。这些结果都支持GO分析的结果，表明果胶的合成收到了抑制。

代谢组分析

作者进行了GC-MS分析来比较对照组和处理组在果实红色成熟期组分之间的差异。通过PCA主成分分析，作者发现第一主成分为是细胞壁和细胞膜相关的糖和渗透胁迫诱导的化合物 ，例如葡萄糖醛酸-甲基-5TMS（2）、木糖-甲基-4TMS、棕榈酸TMS、葡萄糖6-磷酸、甘露醇-6TMS和脯氨酸-2TMS。 第二主成分为氨基酸，第三主成分为有机酸（organic acids）。然后散点图（Scatterplot）分析中，通过火山图中对照组和处理组的比较，作者一共发现了142个化合物（fold change < 1.5）. 其中具有显著差异的作者也做了论述。

代谢通路分析

在转录组和代谢组分析的基础上，作者进行了果实在干旱条件下的代谢谱研究。

转录组分析表明编码果胶酯酶和果胶裂解酶的基因在胁迫组的表达水平要低于对照组。同样的，代谢组分析也揭示半乳糖醛酸、UDP葡萄糖醛酸、葡萄糖醛酸盐、抗坏血酸盐和木糖的含量在胁迫组较低，但 D-木果糖在该组的含量要高一些。因此转录组结果显示，参与脂肪酸合成和代谢的编码酶的基因表达均上调。在代谢组的结果中，硬脂酸与棕榈酸出现了大幅上升，因为这两种成分属于长链脂肪酸DAG（1,2-diacyl-sn-glycerol）的成分，因此作者推测DAG是在成熟的红色番茄中合成的。此外，转录组分析结果也表明编码催化DAG和磷脂酰胆碱的酶的基因PDCT1也出现了上调。这些证据都表明干旱胁迫条件下脂肪酸合成增加导致DAG合成增加，DAG随后转化为磷脂酰胆碱。

在这种情况下，作者则比较了在成熟绿色番茄和成熟红色番茄中磷脂酰胆碱、双棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）和α-亚麻酸（18:3） 的变化，作者发现在这两类番茄未成熟之前，果实中都存在磷脂酰胆碱和DPPC 。然而当番茄成熟的时候，对照组中这两种物质的表达水平都有所下降，而在胁迫组中，种子中表现出来比较高的表达量。在成熟的绿色番茄中，在对照组中，α-亚麻酸在种子附近表达，而在胁迫组中，α-亚麻酸在整个果实中表达。而在成熟的红色番茄中，却是恰好相反的一个结果。

讨论

1、干旱胁迫增加了β-丙氨酸和脂肪酸代谢

β-丙氨酸通过草酰乙酸途径转化为辅酶A（CoA）和酰基载体蛋白（ACP）。CoA和ACP参与几乎所有的代谢途径，包括脂质代谢、磷脂和三羧酸循环。在这个研究中作者观察到胁迫组脂肪酸代谢的激活和磷脂的积累，这可能与β-丙氨酸和草酰乙酸的增加密切相关。

作者还观察到与脂肪酸代谢相关的基因表达显著增加，脂肪酸增加。有研究表明苹果（Malus domestica）果实在长期冷藏期间脂肪酸合成上调，并发现促进脂肪酸合成可维持膜稳定性。同样的在作者的研究中观察到的脂质代谢的上调也通过结构重塑增强了番茄果实细胞膜，使其能够更好地保护种子免受干燥。在转录组分析中，PDCT1是干旱胁迫下表达较高的DEG之一。如成像MS所示，干旱胁迫导致成熟红色果实种子周围PO磷脂酰胆碱和DPPC的大量积累。因此，作者推测合成的脂肪酸用于磷脂的合成，从而导致磷脂的增加。在脱水和渗透胁迫（如干旱）下，在其他植物物种中也观察到磷脂的结构重塑。因此，在干旱胁迫下，成熟红色果实中的脂质代谢上调，这促进了番茄中磷脂的合成，以提高抗旱性。

磷脂酰胆碱是植物质体膜中合成甘油类的前体，这些甘油类化合物在动物细胞中具有体外生理活性，例如抑制癌细胞生长、抑制血管生成和抗炎作用。此外，抗肿瘤和抗炎作用已通过在皮肤和腹腔内局部给药甘油类药物而得到证实，因此由于干旱胁迫导致的磷脂酰胆碱的增加可能导致食用时番茄果实的健康促进质量的提高。

2、干旱胁迫增加α-亚油酸水平并上调Gols表达

实验证明胁迫组中的种子中α-亚麻酸出现了显著积累，α-亚麻酸可以触发植物在胁迫下的防御反应。 先前的报道表明，添加α-亚麻酸可强烈诱导拟南芥中Gols的表达。因此在本实验中，α-亚麻酸在干旱胁迫下增加，随后是Gols表达，这可能是上调的。

3、干旱胁迫改变了细胞壁成分的水平和与其代谢相关的基因的表达

肌醇合成的主要途径涉及IMP27对肌醇-6-磷酸的催化作用 。一般来说，在干旱胁迫下，IMP基因会表达上调。然而在这个研究中，干旱胁迫组中IMP的表达出现了下调，而葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸发生了下调。这表明番茄果实中肌醇是通过Gols介导的途径合成的。 在代谢组分析中，尽管肌醇增加，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的量仍然减少。此外，果胶裂解酶18和PME1.9的水平下降。在干旱胁迫下，番茄果胶代谢发生了变化，但番茄果胶裂解酶18与干旱的关系尚未报道。据报道，编码果胶酯酶1（PE1）的PME1.9和PE2（PE1的一种亚型）的表达下调会导致番茄果实变软。这表明，干旱胁迫下PME1.9表达的减少抑制了番茄果实的软化。 在番茄果实中，201个受干旱胁迫差异上调的基因包括编码纤维素合成酶A催化亚基7和纤维素的基因CSLG2。研究表明，拟南芥的胁迫渗透耐受需要纤维素合成酶A和GALG2。AtCSLG2是番茄CSLG2的同系物，在干旱胁迫期间表现活跃，在干旱应激下其表达被刺激达50倍。这些结果支持了我们的发现，即干旱胁迫导致番茄果实中编码纤维素合成酶A和CSLG2的基因表达增加，但这些基因在果实中的功能仍需阐明。

4、成熟绿色果实中乙烯和茉莉酸生物合成途径下调

转录组分析表明，在番茄成熟绿色期干旱胁迫下，茉莉酸生物合成途径中编码酶的基因表达下调。一般来说，在干旱胁迫条件下，拟南芥等植物中，茉莉酸是由膜脂主动合成的，并诱导了胁迫反应基因。而在这个研究中的结果显示，茉莉酸生物合成途径的下调可能是成熟绿色果实特有的。

至于乙烯，干旱胁迫下调了乙烯生物合成相关基因的表达，如ACS和ACO，它们催化乙烯生物合成的最终阶段，以及编码主要乙烯反应因子的ERF（ERF1、ERF1B、ERF109、ERF5、Pti5和Pti6）。在叶和茎等源器官中，当暴露于干旱胁迫时，茉莉酸和乙烯的水平增加，编码参与其合成的酶的基因表达也增加。与此相反，在这个研究中，推测番茄果实中的茉莉酸和乙烯含量可能降低，因为编码茉莉酸的基因和乙烯生物合成酶的表达降低。

5、干旱胁迫增加了相容溶质的水平 

植物通过合成调节渗透压的物质来应对干旱胁迫，这些是调节细胞内渗透压的相容溶质。脯氨酸和4-氨基丁酸（GABA）均属于相容溶质，在干旱胁迫下，成熟绿色果实中脯氨酸含量增加3.8倍，GABA含量增加1.8倍（表3）。先前对不同番茄品种的研究表明，盐和水分胁迫增加了番茄种子中脯氨酸和GABA的积累。 在动物中，GABA高度集中在大脑中，起到抑制神经传递的作用。摄入的影响包括降压效应、改善阿尔茨海默病、预防糖尿病和增强免疫力。这些定义表明，当食用水果时，干旱胁迫可以提高水果的健康效益。 当遭受干旱胁迫时，植物会急剧改变新陈代谢，以耐受干旱，并产生化合物，帮助它们应对相关的氧化应激。在这项研究中，作者发现在干旱胁迫下栽培的番茄可能比在正常条件下生长的番茄具有更高的生理调节功能 。