外显子测序

外显子测序

1工作原理

2可以得到哪些生物信息

核心技术：针对人外显子序列设计的捕获探针库，探针序列与人外显子的DNA序列相互补，可以和人的外显子序列结合。探针同时也被标上了生物素。捕获试剂盒可以用来建库和捕获了。

• 第一步：先把基因组DNA进行超声打碎，建成DNA文库
• 第二步：把建好的文库和探针可进行杂交。杂交过程中，通过核算序列互补结合的原理，探针会和目标DNA片段进行结合。
• 第三步：用结合了链霉亲和素的磁珠，与这个杂交混合液进行混合。因为链霉亲和素是会和生物素牢固结合的，这样就把捕获的外显子目标片段，通过探针，间接地结合到了磁珠上。

有效测序深度是相对于总测序深度而言，总测序深度是把所有测的的数据量除以目标区域的大小。

影响

1.杂交捕获中有同源序列

2.突出在目标序列之外的不是目标区域-捕获效率

3.duplication：pcr扩增有重复片段：5‘端和3’端完全一样，留下质量高的，成为‘’去 duplication“。

4.测序方法：双端各测125个碱基。会导致左右开始读到中间有大概70bp的序列冗余（重复）。只有180个有效。安捷伦和Hiseq可以得到95*倍测序深度。

3.突变

外显子测序，可以测Germline突变（胚胎形成时就带有的突变），体细胞突变（Somatic Mutation）-主要优势在肿瘤测序方面，原因是外显子测序的深度容易做到深度测序，可100、200，就容易测的肿瘤中的low allete accurancy。

4.外显子测序主要能够得到SNP和Indel信息

进一步做GO和Pathway分析

GO分析：根据突变的点在肿瘤中的富集情况，包括细胞组件、分子功能、对结构变异不敏感，只测序了1%-2%，当断点落在目标区域外，则不能测序。小片段的拷贝数变异不能发现，而大片段的CNV>5M可看到测序深度的变化。

5.全基因组测序找到结构变异和拷贝数变异，在外显子测序找到SNP和Indel变异

6.Panel

特定Panel：315个经常发生突变和28个经常发生重排的基因。由于选择的基因数远小于外显子，就可用比较小的测序量得到较深的测序深度。