A Novel Immune-Related Gene Signature to Identify the Tumor Microenvironment and Prognose Disease Among Patients With Oral Squamous Cell Carcinoma Patients Using ssGSEA: A Bioinformatics and Biological Validation Study
利用ssGSEA识别肿瘤微环境并预示口腔鳞状细胞癌患者疾病的新型免疫相关基因签名：生物信息学和生物学验证研究
发表期刊：Front Immunol
发表日期：2022 Jul 6
影响因子：8.786
DOI: 10.3389/fimmu.2022.922195
一、背景
口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔中最常见的恶性肿瘤，发生在唇、舌、腭、颊粘膜、牙龈、口底和前庭以及后臼区。OSCC的风险因素包括吸烟、酒精摄入、咀嚼槟榔和人类乳头瘤病毒（HPV）感染。OSCC患者的预后通常根据患者年龄、肿瘤组织学分级、TNM分期以及吸烟和饮酒状况进行评估。
免疫检查点基因抑制剂是一种广泛而有效的免疫疗法，它可以阻断抑制性免疫检查点途径，重新激活抗癌免疫反应。抗PD-1免疫检查点抑制剂nivolumab和pembrolizumab是治疗对铂类化疗无反应的复发性头颈鳞状细胞癌（HNSCC）的有效方法。然而，免疫疗法的有效性取决于肿瘤微环境（TME）中宿主免疫反应的重新激活。OSCC是一种高免疫原性肿瘤，其TME的特点是免疫细胞群、免疫检查点和肿瘤或微环境因素的变化，改变了TME的平衡，促进了免疫抑制，使肿瘤逃避免疫监视。
二、材料与方法
1、数据来源
1）329名OSCC患者的数据来自TCGA-HNSC队列
2）以GSE41613的97个OSCC样本（GPL10558平台）作为验证组
3）从ImmPort数据集获取1793个免疫相关基因的列表
4）OSCC细胞系SCC15和正常人类口腔角质细胞（HOK）细胞系
2、分析流程
1）OSCC数据的聚类：sGSEA方法被用来计算OSCC患者中29个免疫细胞及其免疫相关功能和通路标志基因的绝对富集分数，使用R软件包 "GSVA "将TCGA-OSCC中的OSCC样本分为免疫力高的和免疫力低的集群；使用主成分分析（PCA）来评估集群中的每个样本
2）评估免疫聚类的效果：ESTIMATE算法被用来验证ssGSEA聚类的功效；使用CIBERSORT算法分析了两个聚类中的22种肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）；使用R软件包"ggpubr "评估了每个集群中人类白细胞抗原（HLA）家族的表达情况
3）差异性表达基因分析：R "edgeR "和 "limma "软件包被用来进行差异表达基因（DEG）分析
4）基因组改变和基因组富集分析：利用TCGA数据集，进行了拷贝数变异（CNV）和体细胞突变分析，以确定风险分数水平与OSCC某些基因组特征之间的相关性
5）构建基于免疫相关基因表达的临床预后特征：单变量Cox回归分析、LASSO回归分析；使用PCA来评估集群中的每个预后基因；生存分析；单变量和多变量的Cox回归分析，以评估关键的临床因素，如性别、年龄和转移状态，是否可以作为OSCC患者总体生存的独立预测因素
6）蛋白质-蛋白质网络相互作用（PPI）：STRING
7）化疗反应中的模型探索：R软件包 "pRRophetic "被用来计算常用化疗药物的半最大抑制浓度（IC50）
8）细胞培养和转染、RNA提取和定量实时PCR（qRT-PCR）、西方印迹法、克隆发生试验、转孔实验、伤口愈合试验
三、实验结果
01 - OSCC聚类的构建和验证
从TCGA数据库中获得329名OSCC患者的样本。使用ssGSEA对OSCC样本RNA-seq数据进行量化，得到29种免疫细胞类型的浸润水平（图1A）。计算每个OSCC样本的ssGSEA得分，并根据无监督的分层聚类算法将样本分为免疫力高（n=126）和免疫力低（n=203）的集群，这些集群具有不同的免疫浸润模式（图1B，C）。为了验证聚类结果的可行性，采用ESTIMATE算法，根据每个OSCC样本的表达，计算肿瘤纯度和基质、免疫和ESTIMATE分数。免疫力高的聚类组的基质、免疫力和ESTIMATE分数高于免疫力低的聚类组，而肿瘤纯度则较低（图1D）。小提琴图也显示，免疫力高的集群组的基质、免疫力和ESTIMATE分数高于免疫力低的集群组（图1E）。箱线图显示，大多数HLA标志物的表达在免疫力高的群组中也高于免疫力低的群组（图1F），CIBERSORT算法显示，免疫力高的群组中免疫细胞的比例高于免疫力低的群组（图1G）。
图1 口腔鳞状细胞癌聚类的构建和验证
KEGG分析显示，在免疫力高和免疫力低群组中表达的基因与一些趋化因子、Toll样受体、T细胞受体、JAK-STAT、B细胞受体、Fc epsilon RI、NOD样受体和细胞膜DNA感应信号通路相关（图2）。
图2 免疫力高的和免疫力低的集群的基因功能富集分析
02 - 免疫力高的和免疫力低的集群之间差异表达的免疫相关基因的鉴定
探索TCGA数据库中免疫力高和免疫力低的集群之间的DEG表达差异，得到1047个DEG，包括761个上调和286个下调的基因（图3A）。图3B显示了免疫力高和免疫力低聚类中的DEG表达。此外，从ImmPort数据库中获得了1793个免疫相关基因。免疫力高的和免疫力低的集群中的免疫相关基因的表达见图3C。使用ImmPort数据库中的免疫相关基因和免疫力高和免疫力低聚类中的DEGs，也进行了双向Venn分析。这产生了319个重叠的基因，被定义为真正的DEGs（图3D）。
图3 口腔鳞状细胞癌患者免疫相关基因的差异表达分析
在将临床病理信息整合到基因表达谱中后，选择了329名具有完整临床数据的OSCC患者进行进一步分析。采用单变量Cox回归分析来检测350个重叠基因的作用，结果表明18个基因与OS明显相关（图4A）。然后用冲积图来显示这18个免疫相关基因和转录因子之间的关系（图4B）。这些基因的相互作用网络是用STRING数据库建立的，并用Cytoscape显示（图4C）。交叉验证被用来确定LASSO回归算法和18个免疫相关基因的参数的最佳值，以减少预后特征（图4D，E）。然后进行LASSO回归分析，确定了五个免疫相关基因CTSG、TNFRSF4、IGLV1-44、STC2和CCL22后，预后模型取得了最佳性能。CIBERSORT方法被用来评估这五个预后标志物与免疫细胞浸润之间的相关性（图4F）。PCA图被用来验证从DEGs中筛选出来的预后基因在不同免疫集群中的分布，这表明在训练队列中，免疫力高和免疫力低组的预后基因在两个方向（图4G）。利用这五个基因的表达量及其系数，根据以下公式计算每个样本的风险分数：Riskscore=（CTSG的表达量*-0. 235852555481698）+（TNFRSF4的表达*-0.127188255049261）+（IGLV1-44的表达*-0.0157820710202927）+（STC2的表达*0.0909125160196324）+（CCL22的表达*-0.0661762958246814）
PCA图表明，作者从DEGs中筛选出来的预后基因的分布在低风险组和高风险组之间也有两个方向（图4H）。这些发现确定了五个免疫相关的基因是OSCC患者高度敏感和特异的预后指标。
图4 基于免疫相关基因的口腔鳞状细胞癌预后特征的开发
03 - OSCC免疫相关基因的预后标志物的构建和验证
在OSCC患者中验证了免疫相关基因预测OS的有效性和稳健性。训练集（TCGA队列）用于验证免疫相关基因的特征并构建预后模型，而测试集（GSE41613队列）用于独立验证预后风险模型的性能。利用免疫相关的预后模型，计算训练集中每个病人的风险分数，用风险分数的中位数将病人分为高风险组和低风险组。高风险组的患者死亡比例高于低风险组（图5A，B）。KM生存曲线显示，高风险组的患者的OS明显比低风险组的患者差（图5C，D）。然后用随时间变化的ROC曲线来评价从预后模型得出的OS估计值的准确性。在训练队列中，ROC曲线显示，1年、3年和5年生存率的风险分数的AUC值分别为0.654、0.670和0.589（图5E）。在测试队列中，ROC曲线显示，1年、3年和5年生存率的风险分数的AUC值分别为0.691、0.748和0.747（图5F）。图5G-J显示了风险分数和预后标志物的生存状况，图5K，L显示了五种基因预后模型的相关性。
图5 训练和测试集中免疫相关基因预后特征的构建和验证
作者使用R软件包"pRRophetic "研究了风险分数与化疗药物以及一些免疫治疗药物的临床反应之间的关系。通过计算抗肿瘤药物的半数最大抑制浓度（IC50），高风险组和低风险组对20种化学或靶向药物的敏感性有明显差异（图6A）。在训练和测试队列中，大多数免疫检查点在低风险组中都被更多地激活。此外，还发现免疫治疗的一些免疫检查点基因的表达，包括高危组中CD44、CD276、CD40和TNFSF9基因表达的上升，表明它们在各组中具有不同的效果（图6B，C），这意味着可以根据OSCC患者的风险分数来选择最合适的检查点抑制剂。根据CIBERSOFT算法，风险分数与多种类型的免疫细胞的浸润水平呈正相关，包括CD4 T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞（图6D）。还调查了风险分数和免疫疗法预测途径之间的联系，如致癌途径、靶向治疗相关的基因特征和辐射反应基因特征。风险分数与几乎所有的抗癌免疫治疗相关签名的富集分数呈正相关（图6E）。
图6 高危组和低危组对抗肿瘤治疗的临床反应以及免疫检查点相关基因表达情况
采用单变量和多变量Cox回归分析来检验这五个免疫相关基因标志物是否是其他特征（如年龄、性别和等级）的独立预后因素。结果表明，N期是一个独立的预后因素（图7A，B）。
为了从临床角度预测OSCC患者的生存情况，利用TCGA的数据构建了一个Nonogram，可以估计OS持续1、3和5年的概率。年龄、性别、分期、TMN状态和风险分数被列为预测预后的变量（图7C）。45°线代表最佳预测模型，由此产生的校准图表明，Nonogram表现良好（图7D）。绘制了风险分数、Nonogram、性别、分期、年龄和TMN的联合ROC，提名图预测1、3和5年OS率的AUC值分别为0.772、0.868和0.803（图7E）。然后，本研究预后模型的性能与以前使用相同的TCGA-OSCC队列产生的四个代表性预后签名进行了比较。Lv等人、Ribeiro等人、Zhao等人和Zhang等人分别使用8个、7个、4个和5个基因建立了签名。本研究免疫相关基因预后模型的1年和3年生存率的AUC为0.654和0.670，明显高于其他四个预后模型的AUC值。免疫相关基因预后模型的5年生存率AUC为0.589，仅次于Zhang基因Sig（图7F）。这些发现表明，本研究免疫相关基因预后模型在预测OSCC患者的预后方面是可靠和有效的。
图7 构免疫相关基因的预后特征是一个独立的预后因素
04 - 免疫相关基因的预后特征与肿瘤突变负荷的关系
测量高危组和低危组的TMB水平，以确定免疫相关基因预后特征与肿瘤突变负荷（TMB）之间是否存在相关性。高风险组的TMB水平高于低风险组（图8A）。KM生存分析也显示，高风险组的OS概率比低风险组差（图8B）。作者还评估了与TMB有关的免疫相关基因的预测情况。为了研究TMB状态的作用，对低危组/低TMB、低危组/高TMB、高危组/低TMB、高危组/低TMB组进行了生存分析。四组之间有很大差异（图8C）。总之，这些发现揭示了风险分数和体细胞突变趋势之间的联系。然后，进行了拷贝数变异（CNV）分析，以确定风险分数水平是否与某些基因组特征有关。包括TP53、TTN、FAT1、PIK3CA、CSMD3、SYNE1和LRP1B在内的致癌驱动基因在高分样本中普遍被扩增，而CDKN2A、NOTCH1和USH2A在低分样本中被扩增（图8D，E）。
图8 免疫相关基因预后特征与TMB之间的关联性
05 - 实验验证
作者进一步对预后特征中的基因进行了实验分析，以验证它们在OSCC细胞生长和迁移中的功能。由于CTSG和TNFRSF4的系数水平相对较高，并且在之前构建的模型中表现稳健，因此在进一步的实验中评估了这两个基因的致癌作用。与对照组HOK细胞相比，CTSG和TNFRSF4蛋白表达在SCC15中明显下调（图9A，B）。同样，CTSG和TNFRSF4的mRNA表达在SCC15中也明显低于HOK细胞（图9C，D）。
为了探索CTSG和TNFRSF4在OSCC细胞系中的功能，使用pEXP-RB-Mam-EGFP系统在SCC15细胞中过量表达CTSG和TNFRSF4。CTSG和TNFRSF4蛋白和mRNA的表达都被特定的pEXP-RB-Mam-EGFP明显上调（图9E, F）。此外，CTSG和TNFRSF4 pEXP-RB-Mam-EGFP的转染降低了SCC15细胞的克隆原性（图9G）。跨井迁移和侵袭实验表明，CTSG和TNFRSF4的过表达明显减少了SCC15细胞的迁移和侵袭（图9H，I）。伤口愈合实验表明，CTSG和TNFRSF4 pEXP-RB-Mam-EGFP体外转染后，SCC15细胞迁移稳步下降（图9J）。这些发现表明，免疫激活与OSCC恶性肿瘤的进展相关。抗CTSG和/或抗TNFRSF4的药物治疗已被建议为一种潜在的OSCC治疗策略。
图9 使用pEXP-RB-Mam-EGFP转染的CTSG和TNFRSF4过表达抑制OSCC细胞系的生存能力和克隆性
四、结论
研究使用无监督的分层聚类方法来预测对口腔鳞状细胞癌的免疫反应，将口腔小细胞癌患者分为免疫高和低免疫组。高低免疫组之间的免疫评分存在差异。在免疫集群和ImmPort数据库中鉴定出18个与OS密切相关的免疫相关OSCC DEGs。最终鉴定出5个具有重要预后意义的枢纽基因建立预后模型，所有五个特征都与OSCC的预后结局相关。生物学实验验证了这些基因在口腔鳞状细胞系中的行为。研究结果表明，五种已鉴定的免疫相关基因预后特征可作为口腔侵入织物的潜在免疫相关预测生物标志物。开发并确认免疫相关预后特征为具有预测口腔裂缝结局的出色能力的独立生物标志物。
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