客户文章解读 | 代谢组学揭示土壤中工程纳米材料暴露会改变土壤根

作者: 上海鹿明生物 | 来源:发表于2019-05-24 09:57 被阅读57次

代谢组学(metabonomics/metabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。本文为鹿明生物合作客户--南京大学赵丽娟老师课题组2019年4月发表在Environmental Science Nano杂志的代谢组学研究文章，下面一起来看下鹿明技术专家的解读报告。

基本信息

影响因子：6.08

技术：GC-MS普筛

期刊：Environmental Science Nano

材料：玉米根、叶片和土壤样品

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研究背景

环境中工程纳米材料（ENM）的准确风险评估对于纳米技术的可持续发展和应用非常重要。然而以前的研究主要集中在植物或土壤微生物群落的响应方面。土壤代谢组学能够反映植物和微生物群落对ENM暴露的综合反应，但尚未得到广泛应用。另外由于微生物和植物释放的代谢物有助于土壤有机碳（SOC）的形成和积累，因此受植物和微生物活动影响，土壤代谢物改变可能会改变SOC富集。在这篇文献中，玉米种植在含有SiO2、TiO2或Fe3O4等ENM材料（100mg/kg）的土壤里并生长四周，作者使用植物和土壤代谢组学进行了植物和土壤对ENM暴露的全局代谢反应研究。

样本制备

玉米组织：新鲜的玉米叶片和根在液氮中研磨成粉末，并于样品制备前保存在-80℃冰箱中。用甲醇和氯仿提取玉米组织中的代谢物。

土壤样品：取1000mg过筛至2mm，然后在液氮中研磨成细粉末并储存在-80℃冰箱中。样品提取时，用1:1甲醇/水超声萃取（60HZ）2分钟，以提取土壤中代谢物。

研究思路

图 | 研究思路

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实验结果

1.实验样本的表型特征

玉米在含有SiO2、TiO2或Fe3O4 等三种ENM材料（100mg/kg）的土壤种植并培育四周（图1A）。考察叶绿素含量（图1B）、新鲜叶和根重（图1C），以及膜脂过氧化的重要指标——丙二醛（MDA）的含量（图1D）。

图1 | 玉米叶和根系的表型特征

观察到的现象如下:

①暴露于ENM并未导致叶片外观有明显改变；

②在SiO2和TiO2的ENM暴露条件下，光合色素（叶绿素a，b和类胡萝卜素）的水平没有变化。但是Fe3O4导致叶绿素b含量显著增加（p <0.05）；

③Fe3O4使叶片生物量显著增加（p <0.01），但对根和茎没有明显影响。相比之下SiO2和TiO2纳米颗粒对玉米生物量没有显著影响；

④通过测量丙二醛含量评估ENM暴露对细胞膜完整性的影响。结果显示实验用的三种ENM材料没有增加玉米植物的根或叶组织中的MDA水平，表明没有诱导脂质过氧化。

作者也考察了含有不同ENM材料土壤、玉米叶片和根系中多种元素的含量（表1）。

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2.玉米叶片代谢组学研究

通过GC-MS非靶标代谢方法，一共检测出287个代谢物。为了直观反映ENM暴露的影响，使用PLS-DA的方法对不同样本分类。从玉米叶PLS-DA分析结果的得分图（图2）可以看出，与对照相比，暴露于不同ENM条件的叶片代谢物得到明显分离。这些结果清楚地表明，ENM暴露引起玉米叶代谢物谱的改变，并且这些变化依赖于ENM。Fe3O4引起代谢变化最显著，其次是TiO2和SiO2。

图2 | 不同ENM条件下玉米叶代谢物的PLD-DA得分图

进行单变量分析结果发现49种代谢物在暴露条件下发生显著改变。包括被上调或下调的多种氨基酸（见图3）。虽然ENM诱导氨基酸代谢物变化的原因尚不清楚，但氨基酸在多种植物生理过程中发挥着核心作用。另外在ENM暴露的土壤中生长时，含氮化合物4-氨基戊酸（GABA）及其前体（谷氨酸）以及多胺在玉米叶中积累。作者推测GABA及多胺的积累可能是玉米叶片响应ENM暴露的一种防御或应对策略。依赖于ENM的方式不同，TCA循环中柠檬酸，α-酮戊二酸和琥珀酸在代谢途径中显著上调或下调。说明ENM暴露不仅诱导氮代谢扰动，也改变了碳代谢。

图3 | 在ENM暴露下玉米叶片中的上调和下调的氨基酸

上述显著改变的代谢物涉及多条重要的代谢途径。使用MetaboAnalyst 4.0软件分析扰动的生物途径，结果表明，在暴露于Fe3O4 ENM条件下的玉米植物叶11种代谢途径改变，多与氮代谢有关。此外碳水化合物相关途径如TCA循环，糖酵解和糖异生也有明显变化，另外嘧啶代谢途径也发生改变。TiO2 ENM诱导条件下有9种生物途径被扰动，其中7种与Fe3O4暴露重叠（图4A）。TiO2诱导特有的变化代谢途径是甘油磷脂，乙醛酸和二羧酸代谢，其中琥珀酸和异柠檬酸显着改变。此外，SiO2 ENM诱导有6种途径变化。在所有ENM暴露中有三种生物途径都发生改变，分别是精氨酸和脯氨酸代谢，甲烷代谢，泛酸和CoA生物合成。这些代谢途径变化是氮和碳水化合物代谢的核心。

图4 | 玉米叶片和根种发生改变的代谢途径

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3.玉米根代谢组研究

在玉米根组织中，通过GC-MS鉴定出360个代谢物。PLS-DA载荷图（图5）显示对照组和ENM暴露组可以得到很好的区分。尤其是Fe3O4和TiO2样本，清楚地表明了玉米根的代谢物谱发生改变。变化大小遵循Fe3O4 > TiO2> SiO2的顺序，与叶片具有相似的规律。与对照组相比，只有7种代谢物（高香草酸，磷酸盐，D-甘油酸，甘露糖，β-羟基丙酮酸，鸟氨酸和腺嘌呤）含量有显著变化。

生物代谢途径分析表明，Fe3O4暴露下根中仅有4条途径被扰动，明显少于叶片（图4B）。受干扰的途径包括肌醇磷酸代谢，抗坏血酸和醛糖代谢，甘油脂代谢和TCA循环。TCA循环是在根和叶组织中都破坏的途径。柠檬酸和异柠檬酸是TCA循环中的两个重要中间体，在两种组织中均上调，表明在整个植物中能量相关的代谢发生了改变，说明Fe3O4暴露引起了明显的应激反应。TiO2 和SiO2诱导了7种代谢途径的变化（包括肌醇磷酸，抗坏血酸/醛酸，甲烷，乙醛酸和二羧酸盐，TCA循环磷酸盐代谢和TCA循环），表明碳水化合物代谢是根组织中的敏感途径。

图5 | 不同ENMs条件下玉米根代谢物的PLD-DA得分图

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4.土壤代谢组研究

使用基于GC-MS代谢组学鉴定出300种土壤相关代谢物，包括亲水性代谢物（如糖，有机酸，氨基酸和核苷酸）和疏水物质（例如脂质和苯丙素类）。在ENM暴露的样品中与对照组在PLS-DA载荷图（图6）得到明显区分。表明ENM明显改变了土壤代谢物的特征。与对照组相比，一些代谢产物例如左旋葡聚糖、亚麻酸、4-羟基肉桂酸、异肌醇、甘露糖基甘油酯、葡萄糖酸、甲基磷酸酯和甲基-β-D-吡喃半乳糖苷在ENMs暴露样品中均有显著变化（p<0.05，图7）。这些代谢物可归类为糖，氨基酸和酰胺，脂肪族和芳香族酸，以及酚类和脂肪酸，它们都有刺激微生物生长或调节植物生长的作用。植物根渗出的代谢物在植物-植物，植物-微生物（包括病原体）和植物-害虫相互作用中发挥各种作用。值得注意的是观察到的土壤代谢物变化并不完全是根系分泌物代谢产物的结果，土壤微生物群落也有很大贡献。但本文实验设计无法阐明植物和微生物对改变的土壤代谢物的相对贡献大小。

图6 | 不同ENMs条件下土壤代谢物的PLD-DA得分图

图7 | 土壤中一些显著变化的代谢物

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结论

所测试的ENM暴露均未显示对植物生长的负面影响。然而代谢组学分析显示，所有ENM处理均以ENM依赖性方式改变叶、根和土壤的代谢物指纹谱。与SiO2相比，Fe3O4和TiO2的ENM暴露在叶、根和土壤中代谢物的变化更大。有趣的是，不直接暴露的叶组织，在接触ENM环境后氨基酸代谢途径发生了显著改变。在土壤中，左旋葡聚糖，亚麻酸，4-羟基肉桂酸和同种异体肌醇在ENMs暴露环境下显著增加。土壤代谢物谱的改变表明ENM影响了SOC池。

寄语

本文使用GC-MS平台，对叶、根和土壤进行非靶标代谢组学分析，对植物代谢和土壤化学进行全面表征，并使用代谢组学策略研究了玉米植物和土壤对工程纳米材料的反应，结果展示了一个在ENM暴露下玉米的叶，根和土壤中分子变化的全面视角，可以成为ENM风险评估的有力工具。

尤为重要的是，尽管没有直接在土壤中暴露，但植物叶片中可观察到更明显的代谢指纹谱变化，显示出植物传感和源自根区的应激信号传导的重要性。

研究结果表明土壤代谢组学可以成为识别ENM土壤生物反应的有力工具，并且本文所用的代谢组学研究方法为其他污染物的研究提供了非常好的研究思路。

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关于鹿明（www.lumingbio.com)

上海鹿明生物科技有限公司（前身：成立于2009年的上海博苑生物科技有限公司），一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近10年的发展沉淀，公司建立起了 Labelfree、iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台，并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。

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AglientGCMS7890B/5977A（带顶空进样装置）

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