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2022年9月30日，南京农业大学动物科技学院钟翔教授团队在《ANTIOXIDANTS-BASEL》杂志发表题为“m6A RNA Methylation Mediates NOD1/NF-kB Signaling Activation in the Liver of Piglets Challenged with Lipopolysaccharide”的研究论文，该研究通过MeRIP-seq（m6A-seq）等实验揭示脂多糖诱导的仔猪肝脏损伤模型中m6A RNA甲基化介导了NOD1/NF-kB信号激活。
标题：m6A RNA Methylation Mediates NOD1/NF-kB Signaling Activation in the Liver of Piglets Challenged with Lipopolysaccharide（脂多糖诱导的仔猪肝脏损伤模型中m6A RNA甲基化介导了NOD1/NF-kB信号激活）
时间：2022.09.30
期刊：ANTIOXIDANTS-BASEL
影响因子：IF 7.675
技术平台：MeRIP-seq（m6A-seq）、RNA-seq
样本：12头处于生长阶段的雄性仔猪随机分配至两个处理组：对照（CON）组和脂多糖（LPS）组，取肝组织样本进行实验。
实验：细胞培养、siRNA和质粒转染、血清生化参数、肝细胞因子定量、肝脏组织学观察、免疫荧光、活性氧（ROS）检测、RT-qPCR、western blot、MeRIP-seq、RNA-seq
摘要：
N6-甲基腺苷（m6A）是最丰富的内部修饰，广泛参与各种免疫和炎性反应；然而其在仔猪脂多糖诱导肝脏炎症中的调控机制仍然未知。本研究在小猪腹腔注射80μg/kg LPS（LPS组）或等剂量无菌盐水（CON组）进行研究分析。结果表明，LPS处理后可提高血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性，诱导M1巨噬细胞极化，促进炎性细胞因子分泌，从而导致仔猪肝脏损伤。NOD1/NF-κB信号通路在LPS组的肝脏中被激活，且LPS处理后总m6A水平显著升高。MeRIP-seq测序分析结果显示，对照组和LPS组分别有1166和1344个转录本中m6A甲基化，这些转录本的m6A甲基化位点主要分布在5′UTR区、CDS区和3′UTR区。且这些基因主要富集在NF-κB信号通路中，LPS处理使NOD1、RIPK2、NFKBIA、NFKBIB和TNFAIP3 mRNA中的m6A修饰显著变化。此外，METTL3敲除或FTO过表达都使NOD1/NF-κB通路中的基因水平发生变化，表明该通路的激活受m6A RNA甲基化调控，且m6A RNA甲基化水平变化可能与活性氧（ROS）、HIF-1α和MAT2A增加有关。总之，LPS通过改变m6A RNA甲基化激活转录后调控的NOD1/NF-κB通路，然后促进促炎细胞因子产生，最终导致肝脏炎症和损伤。
图形摘要：LPS诱导仔猪肝脏中NOD1/NF-κB信号转导激活的m6A RNA甲基化调控机制
研究结果
（1）LPS诱导的仔猪肝脏炎症和损伤
图1：LPS导致仔猪肝脏炎症和损伤。
（2）LPS通过NOD1/NF-κB信号通路触发炎性反应
图2：LPS诱导仔猪肝脏NOD1/NF-κB信号通路被激活
（3）LPS处理后的仔猪肝脏m6A RNA甲基化图谱
图3：仔猪肝脏的m6A RNA甲基化丰度。
A. ELISA检测整体m6A水平。
B. RT-qPCR检测与m6A修饰相关基因的mRNA表达。
C. Western Blot评估METTL3、ALKBH5和YTHDF2的肝蛋白水平，并通过ImageJ软件进行图像密度定量。
图4：CON组和LPS组肝脏转录组的MeRIP-seq。
A. MEME评估LPS组的共有m6A motif。
B. mRNA转录组中m6A peaks的Metagene谱。
C. CON和LPS组中差异表达的m6A peaks和相关基因Venn图。
D. LPS组前15个m6A修饰基因的GO富集分析。
E. LPS组前15个m6A修饰基因的KEEG富集分析。
（4）NOD1/NF-κB通路受m6A甲基化修饰调控
图5：m6A RNA甲基化调控NOD1/NF-κB信号通路。
A. RNA-seq和MeRIP-seq的联合分析揭示m6A修饰与mRNA表达之间的关系Venn图。
B. IGV分析NOD1、RIPK2、NFKBIA、NFKBIB和TNFAIP3 mRNAs上的m6A peaks图谱。
C. siControl和siMETTL3组中METTL3 mRNA的表达。
D. METTL3敲除对HepG2细胞NOD1/NF-κB信号通路关键基因的影响。
E. OE-NC和OE-FTO组的FTO mRNA表达。
F. FTO过表达对HepG2细胞NOD1/NF-κB信号通路关键基因的影响。结果显示为用垂直条（n=3）表示SEM平均值。*代表CON组和LPS组之间的显著差异；*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
（5）ROS、HIF-1α和MAT2A增加可能导致m6A修饰变化
图6：仔猪肝脏中ROS、HIF-1α和MAT2A的含量。
A. 检测ROS含量。
B. RT-qPCR检测整个肝脏中HIF-1α mRNA水平。
C. RT-qPCR检测整个肝脏中MAT2A mRNA水平。
D. Western Blot评估HIF-1α和MAT2A蛋白水平，使用ImageJ分析进行定量，并标准化为β-肌动蛋白。
结论：
本研究通过MeRIP-seq等实验表明m6A RNA甲基化通过调控NOD1/NF-κB信号通路激活在LPS诱导的肝脏炎症和损伤中起关键作用，揭示了通过LPS诱导的ROS、HIF-1α和MAT2A表达增加有助于提高仔猪肝脏中m6A RNA甲基化的可能性。表明NOD1和m6A RNA甲基化可能是研究和处理仔猪免疫应激诱导肝损伤的新观点。
参考文献：
XuM, Zhuo R, Tao S, Liang Y, Liu C, Liu Q, Wang T, Zhong X. M6A RNA MethylationMediates NOD1/NF-kB Signaling Activation in the Liver of Piglets Challengedwith Lipopolysaccharide. Antioxidants (Basel). 2022 Sep 30;11(10)
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