作者：尧小飞
审稿：童蒙
编辑：angelica

引言

这几年单细胞实验和分析技术如雨后春笋般涌现，相关文章也层出不穷，各种软文也是铺天盖地。作者呕心沥血整理了一篇关于单细胞的长文，详细介绍单细胞转录组分析的整体分析。本文是第一篇，我们一起来看看单细胞转录组的基本知识。

01 什么是单细胞转录组？

单细胞转录组就是某一时刻单个细胞内所有mRNA总表达量，其表达量反映该细胞的总体特征。随着2009年汤富酬老师首先开发单细胞转录组技术后，单细胞转录组技术如雨后春笋般涌现出来，比如Smart-seq、CEL-Seq、Quartz-Seq、Drop-seq、InDrop-seq、Smart-seq2等等。单细胞转录组技术的出现使得我们可以把研究的精度从组织多细胞层面精确到单个细胞领域，可以单独研究某个细胞或者某群细胞具体的特征，特别是对于细胞发育、肿瘤微环境、单细胞图谱绘制方面发挥了关键作用。

单细胞转录组的平台有很多，常用的有10xGenomics、BD Rhapsody、Fluidigm C1、Bio-Rad等平台，其中10xGenomics单细胞转录平台由于其成本优势和通量优势，是最常见的一种单细胞解决方案提供商，其在市场上处于绝对优势。10xGenomics单细胞转录组平台能够一次高效地捕获100-80,000细胞（一个芯片），1000个细胞的双细胞率仅为0.9%，是目前最为常用的单细胞捕获平台。

在这里主要也是介绍基于10xGenomics单细胞转录组平台数据进行的后续生信分析以及注意事项。

02 为什么要进行单细胞转录组研究？

普通转录组（Bulk RNA）是生物组织样品中在某个时间对应的所有mRNA转录情况，通常作为组织或者样品某个时刻状态的重要指标，不同的样品、不同组织、不同物种、不同的处理都会造成mRNA表达情况的改变，从而调控机体的生命状态或者执行某些细胞功能，相对于蛋白而言，mRNA的稳定性和检测的便利性，大大促进了转录组技术的发展和应用。

Bulk RNA表达水平是反映样品的平均表达量水平

“Every cell is unique—it occupies an exclusive position in space, carries distinct errors in its copied genome and is subject to programmed and induced changes in gene expression. Yet most DNA and RNA sequencing is performed on tissue samples or cell populations, in which biological differences between cells can be obscured by averaging or mistaken for technical noise.” ----Method of the Year 2013(Nature Methods )

但是样品或者组织的转录组是所有细胞的一个转录组表达量的平均值，不能反映样品中所有细胞或者某群细胞的状态，因此需要对单个细胞的或者某群细胞的转录状态进行深入的研究，这样将更精细、更准确反映组织的状态。 如果在进行免疫或者药物反应研究的时候，可以更精准地针对细胞或者细胞亚群进行免疫治疗或者靶向治疗，这是精准医疗必要条件。

03 怎样进行单细胞转录组研究？

在思考这个问题之前，我们首先需要考虑的是什么是单细胞转录组？只有了解单细胞转录组本质以后，才能更好了解如何去研究？

10xGenomics单细胞转录组基本流程如下图所示，我们最终得到的是一个表达矩阵，此矩阵一般每行为基因，每列为细胞。其实这个矩阵就是每个细胞所有的基因表达情况。

后续10xGenomics单细胞转录组的分析几乎都是基于上述方式得到的表达矩阵进行分析的，不管是聚类还是发育轨迹构建，其实单细胞转录组研究的本质就是研究我们捕获细胞的的异质性，也就是研究细胞与细胞具体有什么差异，研究样品中有什么类型的细胞，这些细胞有什么差异。

异质性具体如何研究？虽然现在单细胞转录组分析的工具和方案有几百种，就本质来说，只有两种研究方法：一种是细胞类型的差异；另外一种是发育轨迹的构建。现在所有的工具都可以归类到此两类。

单细胞转录组表达矩阵的获取
10xGenomics单细胞转录组表达矩阵一般是通过cellranger软件获取，cellranger为10xGenomics官方分析软件，一般后续高级分析或者重新分析都是基于此矩阵。

具体cellranger使用方法如下图所示：

一般cellranger资源消耗如下图所示：

这一篇我们对基本知识进行了介绍，同时讲解了如何获得表达量矩阵。下一篇我们会介绍详细的单细胞转录组亚群分析过程和原理，请大家继续关注。

参考文献
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