杂志：Frontiers in lmmunology
影响因子：5.7
研究概述：
乳腺癌 （BRCA） 是全球癌症相关死亡的重要原因。目前的治疗方法面临耐药性和转移等挑战。免疫信号转导由染色体不稳定性 （CIN） 触发，产生错位的 DNA 结构，激活干扰素基因的环状 GMP-AMP 合酶刺激剂 （cGAS-STING） 通路。作者从Reactome数据库中收集了STING通路相关基因（SRG）, 整合了从TCGA-BRCA队列和GEO数据库中的BRCA患者的RNA-seq数据，使用limma包分类差异表达的基因，发现BRCA组织中STING1整体下调，TBK1上调。通过共识聚类分析，作者将肿瘤组织划分为两个不同的组，IOBR包分析发现两组之间的免疫浸润细胞存在差异。随后作者使用lasso回归和多因素Cox回归分析制备了与STING通路活性差异相关的预后模型。相关性分显示，风险评分较高的BRCA患者总体免疫激活受到抑制。药物敏感性分析则显示吉西他滨在低风险组中结局更有利。单细胞分析证实了预后模型在单细胞水平上如 CD8 T 细胞和肿瘤内自然杀伤细胞中的活性。
研究结果：
乳腺癌患者STING通路相关基因的转录差异
作者比较了TCGA数据集中BRCA患者在不同组织类型(图1A)，年龄人群(图1B)和临床阶段(图1C)中16个SRG基因的表达情况以及体细胞突变状态（图1D）。除 NLRP4 和 TRIM21 外，其余 13 个基因在正常组织和肿瘤组织间的表达差异显著。值得注意的是，STING1 在 BRCA 组织中的表达下调，而 TBK1 的表达增强。此外，3 个 SRGs 的表达与患者年龄的差异显著相关。DDX41 、 DTX4 和 NLRC3 在 65 岁以上的患者中下调。然而，SRGs 和临床分期的相关性并不明显。在 16 个 SRGs 中，TCGA 队列中 PRKDC 的突变率最高。
使用STING通路相关基因对TCGA-BRCA数据集的共识聚类
使用 ConsensusClusterPlus 包将 16 个 SRG 的表达水平用于执行无监督聚类分析，将 TCGA 数据集中的肿瘤组织分为两个不同的组，即 C1 和 C2（图 2A-C）。热图显示两个亚簇之间的 16 个 SRG 存在明显的表达差异， 其中XRCC6 表达的最显着差异（图 2D）。在C2 亚组中 IV 期和老年人口的百分比较高，这与生存分析结果一致，并且 C2 的预后显着较差（图 2E）。免疫浸润结果表明 C1 中 ESTIMATEScore、ImmuneScore、StromalScore评分都更高（图 2F）。免疫浸润进一步评估两个亚集群的免疫细胞差异（图 2G）。
M2 巨噬细胞在 C2 亚簇中的丰度显著较高，而另一种关键的免疫抑制细胞类型，即 Tregs，在 C1 BRCA 组织中高度丰富。总的来说，这些结果表明 M2 巨噬细胞可能在塑造 BRCA 中的免疫抑制 TME 而不是 Tregs 中发挥主要作用，此外，还暗示着 STING 通路激活与 M2 浸润之间存在潜在关联。作者还评估了免疫检查点抑制剂表达的差异在两个簇之间的差异，其中CD276 、 PVR 和 TDO2 的表达在 C2 中显著上调（图 3A），而 AKR1C1 和 MGMT 在 C2 亚组中高表达 （图 3B），表明这两个亚组的放疗敏感性存在潜在差异。通过富集分析检测两个分组之间的通路差异（图4A-B）, 在C2组中观察到细胞周期通路（图4C）和细胞因子-细胞因子受体的富集(图4B)。此外哺乳动物雷帕霉素信号转导、细胞干性和肌动蛋白调节的靶标在两个簇中也受到差异调节（图 4D、E）。
检测与STING 通路相关的基因簇
利用limma包分析C2和C1组之间的差异表达基因（图5A）,并依据差异基因的表达对病人再一次进行共识聚类， SRG相关deg可以将病人划分为三组， STING信号通路相关基因在这些组之间的表达明显不同(图5B)，且在基因簇1中病人的生存结果最差（图5C）。
STING通路相关预后模型的开发与验证
基于已确定的与STING通路相关的DEG， 使用LASSO和多因素Cox回归分析开发了一个预后模型（图6A-B）, 特征基因系数棒棒糖图显示TMEM31 的系数值最高，其次是 WT1 和 KIAA031
图7A展示在TCGA训练集中预后模型展现出高预后分层能力，该模型在其他两个GEO数据集中仍保持着分层效果（图7B-C），Time-ROC曲线的线下面积均大于0.6，表明模型的预测能力较准确。作者比较了以根据SRG共聚类后的患者分组与患者风险评分之间的关系，C2亚组的风险评分较高（图7D）， 差异基因共聚类分簇后的簇一也具有较高的风险评分值（图7E），同时在16个SRGs在不同风险评分组的表达水平比较中，高危组表现出STING1和TBK1的显著上调（图7F）。
风险评分与肿瘤微环境的相关性分析
作者发现较高的风险评分显著抑制了补体激活、免疫球蛋白的产生和吞噬作用，表明风险评分较高的 BRCA 患者的免疫激活受到显着阻碍（图 8A）。所有三种免疫评估都一致显示出相似的结果（图 8B）。模型组成基因CCL5 、 CP 、 ZFP57 和 TNFRSF14 的表达与 M1 巨噬细胞浸润高度相关，而与 M2 丰度呈负相关（图 8C）。在枢纽基因中，系数值最高的 TMEM31 与免疫抑制标记基因 LAG3 和 ICOSLG 的表达呈正相关（图 8D）。在较高的风险评分中，CD8 、 CD4 和 B 细胞的浸润明显降低，而 M2 与风险评分呈正相关（图 9）。在枢纽基因中，SHCBP1 与 EZH2 表达高度相关，而 PCOLCE 与 TBX5 高度相关（图 10A），表明这些基因可以作为潜在的新型生物标志物来评估对 BRCA 化疗的敏感性。此外，EZH2 与风险值表现出高度相关性 （图 10B）。药物敏感性预测分析显示，高危组吉西他滨的 IC50 值较高，表明低风险组的结果更有利（图 10C）。
乳腺癌中单细胞测序数据集中高度激活的STING通路相关特征
通过分析三个公开的单细胞 RNA-seq 数据集，在单细胞水平上进一步研究了预后模型的活性。在进行了质量控制、降维和聚类分析后，生成了总共 27 个子簇（图 11A、B），随后根据标记基因的表达水平注释为 12 种主要细胞类型（图 11C），如图 11D、E 所示。肿瘤内 NK 细胞表现出高度激活的 STING 通路相关特征，进一步支持预后模型与 BRCA TME 的临床相关性（图 11F）。
TMEM31 在调节 BRCA 增殖和迁移中的多功能作用
在这项研究中，作者确定 TMEM31 是预后模型中的主要危险因素，因此作者进行了TMEM31在乳腺癌细胞中的功能实验。作者观察到 TMEM31 的上调导致DU4475细胞迁移能力增强（图 12A）。TMEM31 的上调和下调分别促进和阻碍 DU4475 的细胞增殖速率（图 12B）。在BT-549 细胞中也存在类似的结果（图 12C、D），图13D的EDU测定也再次验证这一结论。集落形成测定实验进一步表明 TMEM31 的缺失或过表达影响了它们的集落形成能力（图 13A、B）。在 BT-549 和 DU4475 细胞中，操纵 TMEM31 水平改变有助于改变侵袭状况（图 13C）。流式细胞检测发现在 BT-549 和 DU4475 细胞中 G2/M 细胞的比例与TMEM31的表达正相关（图13E）。综上所述， TMEM31 在调节 BRCA 细胞增殖和迁移中存在多功能作用。
研究总结：
该文章也是基因集在癌症中的研究，作者以STING通路相关基因出发，先研究了这些基因在乳腺癌中的表达和基因组情况，随后以这些基因的表达矩阵进行共识聚类，将乳腺癌患者划分为两个亚组，比较了亚组间的免疫检查点和化疗相关基因的表达差异，分析了两个亚组之间的通路变化，随后作者筛选出两个组间的差异基因并构建了预后模型，该模型将患者划分为高低评分两个分组，作者进一步比较了风险评分分组与肿瘤微环境、化疗敏感相关基因的相关性，同时也在单细胞数据中构建了STING通路激活特征，并寻找与其相关的细胞类群。最后作者在体外对模型组成基因TEM31进行了功能验证。这些发现对BRCA患者的个性化治疗和管理具有重要意义
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