题目：Single-Cell Analysis of Ploidy and Transcriptome Reveals Functional and Spatial Divergency in Murine Megakaryopoiesis
中文题目：倍性和转录组的单细胞分析揭示了功能和空间小鼠巨核生成的分化
目的：
为了克服获得罕见的、超大的、高度多倍体和脆弱的MK细胞的困难，我们开发了一种高效的分离策略，从小鼠脑脊髓瘤中收集活的MK细胞。我们的发现揭示了MK体内新的分子、空间和功能异质性，并证明了可能作为一种新型免疫细胞的特化MK亚群的存在
内容：
- 收集小鼠和人骨髓中不同倍性的巨核细胞进行测序
- 降维及差异表达基因的鉴定
- 为了更好地追踪人和小鼠MK亚群，对小鼠骨髓MK亚群的原位免疫染色。
- 为了确定脑转移中与内源性造血干细胞相关的MK细胞的身份，我们应用先前报道的三维免疫荧光成像技术来识别造血干细胞，并计算造血干细胞与mks4之间的距离。
结果
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经过严格的细胞过滤，收集自12只小鼠的795个单细胞的高质量转录组留作后续分析。从2N到32N的细胞都高表达MKs的标记物，如Itga2b (CD41)，Pf4, Itgb3 (CD61)和Gp9 (CD42)。倍性越高，标志基因的表达量越高。
小鼠scRNA
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2亚群细胞中，WNT信号基因，包括Wnt3a，Wnt4、Dkk1和Dkk2在亚群2中特异高表达(补充图3G)，这可能通过MK来提供新的信号来调节HSC稳态。
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亚群4细胞表达与血小板产生和止血有关的关键基因(图2C)，包括前血小板形成(Tubb1、Myh9)、血小板粘附(Vwf、Gp1ba、Gp5、Gp6)和血小板活化(P2ry1 P2ry12)。在亚群4中发现的转录因子包括，GATA2、NF-E2和FLI-1众所周知调节MK发育和血小板生成。一些已知的靶点NF-E2在亚群4中也高表达。
小鼠scRNA
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根据轨迹分析，发现亚群1是起点，可能会进一步分化为2、3、4亚群。亚群1具有低倍性，高表达Kit and Cd34，可能是MK祖细胞。
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为了进一步研究小鼠与人类的MK异质性，我们从4名健康人类供体中分离并测序了跨越每个倍性阶段(2N-32N)的768个CD41 +纯化的bm来源的人类MKs。分析了700个MKs的高质量单细胞测序转录组。在UMAP分析中，有四个亚群与我们在小鼠MKs中观察到的显著相似。
人和小鼠对比
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对小鼠和人MKs的综合分析显示聚类为1、3、4亚群的人与小鼠的MKs分布相近，人与小鼠MKs的亚群2则是分散分布的。
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Mylk4，它编码肌球蛋白轻链激酶4(图3A) 为了更好地跟踪这些新发现的MK亚群，我们决定以具有潜在生物学功能的第2、3和4类为重点。亚群2 (HSC-niche MKs)由表达。
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亚群3(炎症反应相关的MKs)可以被特异性识别通过炎症和吞噬过程中免疫细胞迁移调节因子Lsp1和参与细胞粘附和免疫细胞活化的白细胞特异性表面分子CD53的表达。
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ARNTL + MKs在三个聚类中，(聚类4)的MKs比例最高(24.5±1.1%)，这与血小板生成是MKs的主要功能的认识一致(图3E)。这些结果表明，MK亚群在mRNA和蛋白水平上均可通过特异性标记进行表征。
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ARNTL + MKs细胞平均直径最大(亚群4,20 -45μm;平均值为31.5μm)。MYLK4 + MKs(亚群2)略小于ARNTL + MKs (29.7μm vs 31.5μm)，而LSP1 + MKs(亚群3)细胞大小最小，平均直径为7.4μm(图3F)。这些结果与来自倍性和转录组分析的数据一致，显示聚类亚群4血小板生成和亚群2 (HSC-niche MKs)由高倍性细胞组成，而亚群3(炎症反应相关的MKs)由低倍性细胞组成(图3)。
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MKs需要与血管接触才能产生血小板。此外，为了保持造血干细胞静止，MKs需要与造血干细胞在物理上相关联。基于之前的观察，我们假设具有不同表达特征的MKs会在BM中表现出独特的空间组织。
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ARNTL + MKs(簇4，血小板生成MKs)与血管直接接触0.34μm，而MYLK4 + MKs(簇2)或LSP1 + MKs(聚类3，炎症反应相关的MKs)与血管的平均距离显著增大，分别为6.5μm和11.3μm。
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总之，聚类2和4的独特空间分布与从各自的转录组marker推断出的不同功能一致，并支持血小板生成和HSC维持是由两个不同的群体进行的。
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我们发现93.6%的前血小板定向MKs表达ARNTL (CD41 +和ARNTL +共染色)(图4E和4F)。
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