NGS基础 - 高通量测序原理

1. 文字详解

https://mp.weixin.qq.com/s/SS9YBSpgUoU9gI86u-0ATg?

2. 视频连接

https://v.youku.com/v_show/id_XNzEzNzk1NTA0.html

3. RNA测序概述

https://zhuanlan.zhihu.com/p/26319993

4. 基因测序原理——以BGISEQ-500为例

https://www.jianshu.com/p/8289f1cc5dd7

5. 单端测序与双末端测序问题

https://www.jianshu.com/p/5c238ea7c52f

6. 二代测序结果比较：Hiseq Xten VS NovaSeq 6000

从1977年Sanger发明了双脱氧链终止法一代测序技术开始，测序技术发展至今已有四十多年时间，先后经历了以GS FLX、Solexa、SOLID为基础的二代测序技术，以及基于单分子实时测序（SMRT）和纳米孔测序技术的三代测序技术。虽然三代测序在蓬勃发展，并在基因组和转录组测序等领域展现出前所未有的优势，但限于成本问题，其应用范围尚不及二代测序。

二代测序技术以其短读长、高通量、准确性高的特点，仍在测序市场上占优势地位。以Illumina Solexa为例，首先利用超声波将DNA打断成200-500bp小片段文库，加接头后DNA片段随机附着于flowcell表面，经过桥式PCR扩增形成“DNA簇”，实现碱基信号强度放大，采用边合成边测序的方法，进行全基因组全面，准确的测序。

图1 Hiseq Xten (左) 与 NovaSeq 6000

2014年Illumina推出HiSeq X Ten测序仪，它利用数十亿个纳米孔的流动槽，较大缩短了测序周期。2017年它又推出了新一代测序仪NovaSeq系列，我们以相同文库分别进行Hiseq Xten系列和NovaSeq系列测序，DNA重测序产出数据指标如下：

表1 DNA重测序结果比较

看完重测序，再看看转录组文库测序比较：

表2转录组测序结果比较

基于以上结果，总结了以下几点：

1.测序原理：X-ten与Nova6000测序原理均是基于solexa的边合成边测序的原理；Nova6000采用Illumina的EX-AMP簇生成技术，以及新一代的Patterned Flow Cell。

2.Q30质量值：在实际测序中Nova6000的Q30相对于X-ten更稳定且测序时长更短，试剂衰减对质量影响更小，整体的Q30 Nova6000要优于X-ten。

3.测序方式：受限于X-ten的控制软件以及试剂等因素，X-ten只能进行单Index的测序识别；而Nova6000可以进行I7 I5双端Index的测序，理论上可以做到更精准的识别。

4.DNA文库冗余度：Nova6000明确优于X-ten平台。

有木有发现随着二代测序仪器的发展，测序结果真是又快又好，目前二代测序较多的应用于基因组重测序，转录组分析，小分子RNA研究等领域。基于二代测序技术进行遗传图谱构建，基因定位的研究也越来越多。