基础知识——illumina测序原理

二、高通量测序---illumina测序原理

高通量测序技术（High-throughput sequencing）以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。（百度百科）

根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等。主要有以下几种：

高通量测序

今天主要介绍其中的一种Illumina测序

1.Illumina测序

设备认识

illumina最新的X Ten测序仪

基本步骤

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①：准备样品

制备样品的方法有很多种，但是所有制备方法都是在DNA片段的末端添加接头，通过循环扩增的减少，额外的基序(motif)被引入。例如测序结合位点、标签和与Flowcell(流动池)寡核苷酸互补的区域。

建库

adapter是加上特异的碱基A后利用互补配对原则而加上的，adapter可以分成两个部分，一个部分是测序的时候需要用的引物序列，另一部分是建库扩增时需要用的引物序列。

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②：成簇

每个片段分子被等温扩增的过程。 Flowcell是带有流通槽的玻璃滑块。每个流通槽上都进行了化学修饰，固定了2种DNA引物。这两种DNA引物的序列和接下来要测序的DNA文库的接头序列相互补。

Flowcell

如上图所示即为一个flowcell，每个flowcell上都有8条lane，又称为泳道，用于测序反应，可以添加试剂，洗脱等。tile是每一次测序荧光扫描的最小单位。

flowcell上固定着无数的引物P5'和P7 image

• 待测序列通过P5与flowcell上的P5’序列杂交互补，以待测序列为模板进行互补链的延伸，互补链的两端为P5'和P7'。 image

• 接下来模板链被切断并洗下，互补链的P7'与flowcell上的P7杂交互补，进行链的合成，这一过程就是桥式PCR

桥式PCR

接着合成的双链被解链，再分别于Flowcell上的其他接头杂交互补，延伸，解链，杂交，延伸，解链...如此重复循环，同时生成了数百万个簇，使所有片段被克隆扩增。

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• 桥式PCR完成后，将双链解链，将与P5'相连的互补链切断洗去，留下了与Flowcell上P7连接的链，也就是模板链，同时，游离的3'端被阻断，防止不必要的DNA延伸。

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③：测序

• 测序引物结合到靠近P5的测序引物结合位点1上，在系统中加入四种dNTP和DNA聚合酶。

此处dNTP有两个特点，一是它有荧光基团标记，每种碱基标记的荧光基团不一样；二是它的3'末端连了一个叠氮基，它能够阻断后面的碱基与其相连。

在这一过程中荧光标记的核苷酸竞争加入生长链。基于模板序列，仅有一个核苷酸并入，在添加每种核苷酸之后，簇被光源激发，并发射出特征荧光信号，这个专有过程被称为Sequences-by -Synthesis。循环的次数取决于读段的长度。发射波长与信号强度一起决定了碱基读出。对于给定的簇，所有相同的链同时读取