影响因子：5.80
研究概述：
肾细胞癌每年影响超过40万人，其中70%为透明细胞肾细胞癌(ccRCC)。靶向药物和免疫检查点抑制剂(ICIs)虽能改善晚期患者预后，但仅适用于少数患者。研究基于ICIs免疫疗法相关的生物标志物可指导ccRCC的个体化治疗和管理。Notch通路是一种进化上高度保守的信号传导机制，参与肾损伤、糖尿病肾病、遗传性疾病和肾癌的发生。同时，Notch激活参与调节肿瘤干细胞的自我更新和分化和血管生成，介导肿瘤细胞与肿瘤免疫微环境之间的交流。基于Notch激活信号在抗肿瘤免疫治疗中的重要作用，作者假设Notch激活可能定义一种免疫抑制表型并与ccRCC中ICIs的不良获益相关。作者通过分析TCGA数据集中的Notch通路基因，识别出3个具有不同预后和分子特征的基因簇。基于差异表达基因构建与Notch激活、血管生成、PI3K AKT-mTOR活性、VEGFR/mTOR抑制剂敏感性相关的Notch评分。结果显示，与正常肾组织相比，Notch通路基因在肾透明细胞癌中存在差异表达。Notch评分低可能预示着对VEGFR/mTOR抑制剂的敏感性较差，而对基于ICIs的免疫治疗显著获益。
研究流程如下：
研究结果：
Notch通路基因的基因组和转录组景观
基于cBioPortal和molecular signatures数据库中Notch通路相关的特征，作者共确定了62个Notch通路基因用于本文研究。在TCGA-KIRC队列中，作者发现除MAML1(25.3%)、KAT2B(13.6%)、SPEN(12.3%)和EP300(6.3%)之外，大多数Notch通路基因的基因组改变频率均较低(<5.0%)。而与正常肾组织相比，肿瘤样本中66.1%(41/62)的Notch通路基因表达升高，14.5%(9/62)的Notch通路基因表达降低(图2A)。以上结果表明Notch通路基因的基因组和转录组改变在ccRCC的肿瘤发生和发展中具有潜在作用。
Notch通路定义了一种具有免疫抑制的侵袭性亚型
作者首先分析了每个Notch通路基因mRNA水平之间的两两相关性(图2B)。结果表明，除RBPJL、PSENEN、DLL3和HES7外，其余Notch通路基因mRNA表达水平之间均呈正相关。接着，作者根据62个Notch通路基因的mRNA水平进行了无监督聚类分析，将所有ccRCC样本分为3个簇（mRNA簇A、mRNA簇B和mRNA簇C）(图2C)。作者发现除RBPJL、PSENEN、DLL3和HES7外，大多数Notch通路基因在mRNA簇A中表达较高，这与先前两两相关的结果一致(图2B)。同时，大多数基因表达较高的mRNA簇A预后较好，而表达相对较低的mRNA簇C总体生存较差(OS, p < 0.001，图2D)，这些结果表明长期生存与NOTCH1、JAG1/2、DLL4和HEY1.30的高表达密切相关。
此外，作者估算了3个mRNA簇与临床病理特征、常见突变基因的基因组改变、HALLMARK基因集的富集评分和免疫细胞浸润之间的关联。结果表明，mRNA簇C倾向于VHL和PBRM1(图3A)的突变较少。mRNA簇A在Notch相关通路、血管生成和PI3K-AKT-Mtor相关通路的评分较高(图3B)，表明Notch通路的激活可能与抗血管生成药物和PI3K-AKT-mTOR抑制剂的更好反应相关。而mRNA簇C的DNA损伤修复通路评分较高，TGF-b通路评分较低(图3B)，并且倾向于有更多的“激活”/“促炎”而不是“静止”/“抗炎”肿瘤浸润免疫细胞(图3C)。这些结果表明，Notch失活可能预示着ccRCC对VEGFR/mTOR抑制剂的反应较差，而对ICIs治疗的反应较好。
Notch评分的构建及其生物学和免疫学相关性
基于mRNA簇B在Notch通路基因的表达(图2C)、生存(图2D)、HALLMARK通路的ssGSEA评分(图3B)和免疫细胞浸润(图3C)上处于mRNA簇A和mRNA簇C之间。因此，作者利用mRNA簇A和mRNA簇C之间的差异表达基因来建立一个反映Notch激活的评分用于后续的生物标志物分析。作者首先比较了mRNA簇A和mRNA簇C之间Notch通路基因的mRNA表达。图4A显示，mRNA簇A中共有55个Notch通路基因高表达，2个基因(DLL3和PSENEN)低表达。其中，DLL3已被确定为抑制性Notch配体。同时，作者发现PSENEN和NOTCH受体基因(NOTCH1-4)的mRNA水平呈负相关(图4A)。该结果表明，DLL3和PSENEN的表达可能与Notch的激活呈负相关。
为了反映Notch在肾透明细胞癌中的活化水平，作者使用上述55个“高表达”和2个“低表达”的Notch通路基因构建了Notch评分。图4B表明，Notch评分在组织学分级较差的样本中，或在TCGA研究网络(TCGA Research Network)研究中的TCGA-4簇中较低。此外，Notch评分与性别和TNM分期无关(图4B)。为了评估Notch-score的稳健性，作者在三个独立队列中分析了更广泛的特征。作者首先计算了Notch评分与这3个队列中1,603个Reactome特征的ssGSEA分数的Spearman相关性（图4C）。虽然TCGA数据集主要由早期ccRCC组成，而其他两个试验仅包括晚期和转移性的ccRCC，但Notch-score与其他通路在不同队列中的相关性高度一致（图4D），表明Notch-score在早期和晚期ccRCC中具有相当的可信度。此外，作者发现Notch评分与Notch通路相关的富集评分显著相关(图4E)，表明Notch评分可以反映Notch的激活水平。Notch评分与DNA修复、细胞周期、细胞死亡、抗原处理与呈递、B/T细胞受体下游信号、类固醇代谢相关评分呈负相关，与TGF-b、PI3K-AKT、VEGF通路相关评分呈正相关(图4E)。Notch评分还倾向于与更多的“静息”/“抗炎”而不是“激活”/“促炎”TIICs相关(图4F)，这与之前描述的结果一致。这些结果表明，Notch评分与通路活性和TIME密切相关，且Notch评分可能在预测肾透明细胞癌对VEGFR/mTOR抑制剂和免疫治疗的反应性方面具有潜在的实用价值。
Notch评分与ccRCC细胞系药物敏感性的关系
基于Genomics of Drug Sensitivity in Cancer数据库中ccRCC细胞系的IC50数据，作者分析了Notch评分与靶向药物敏感性的关联(图4G)。先前的研究表明，HDAC抑制剂通过调节多种途径诱导肿瘤细胞的生长停滞和凋亡；同时，这些抑制剂也可以导致Notch的激活，从而部分减弱其抗肿瘤活性。据推测，在Notch信号已经被强烈激活的肿瘤细胞中，这一副作用是多余的。图4G中的Notch评分高与HDAC抑制剂敏感性之间的关联在一定程度上支持这一假设。研究表明，PARP抑制剂在同源重组缺陷的肿瘤中发挥抗肿瘤作用。根据图4E中Notch评分与同源重组修复激活的负相关关系，作者发现Notch评分与PARP抑制剂的IC50呈负相关(图4G)。此外，高Notch评分与细胞周期信号的失活以及PI3K-AKT-mTOR和VEGF通路的激活相关(图4E)，而在图4G中，Notch评分与对引起细胞周期阻滞的药物的低敏感性以及对PI3K-AKT-mTOR和VEGFR抑制剂的高敏感性相关也证实了这一点。以上结果表明，Notch评分高的ccRCC可能对VEGFR/mTOR抑制剂有较好的反应。
Notch评分预测阿维鲁单抗联合阿西替尼优于舒尼替尼的益处
在JAVELIN试验(阿维鲁单抗+阿昔替尼vs.舒尼替尼)和CM-009/010/025试验(纳武利尤单抗vs.依维莫司)的两个大数据集中，作者进一步研究了Notch评分与免疫治疗(相对于VEGFR/mTOR抑制剂)带来的益处之间的关联。作者将JAVELIN队列中有RNA-seq数据的726例ccRCC患者按2∶1的比例随机分为训练集和验证集，探索具有最佳预测能力的Notch评分界值并进行验证。图5A展示了该队列的基本特征和Notch评分。作者发现，在所有截止点，低Notch评分组的治疗效果均大于高Notch评分组(图5B)。同时，两亚组之间的治疗效果差异在第64.7百分位数的截断值达到最大(图5B)。在该截点，阿维鲁单抗联合阿昔替尼比舒尼替尼的获益比在低Notch评分组中相当大，而在高Notch评分组中可忽略不计(图5C)。作者使用相同的截断值在验证集中观察到相似的结果(图5D)。此外，在全部726例患者中，Notch评分较低的患者在阿维单抗联合阿西替尼治疗中生存率较高，而在舒尼替尼单药治疗中生存率较差，从而获得更大的获益(图5E)。
DLK1/2作为内源性NOTCH拮抗剂，可竞争性结合NOTCH受体，从而降低NOTCH活性。在Notch通路普遍激活的ccRCC中，DLK1低表达而DLK2高表达，提示DLK1可能是ccRCC中Notch活性的主要抑制剂。鉴于此，作者假设DLK1可能具有与Notch评分相反的预测能力，并分析样本中DLK1/2表达与治疗效果的关系。结果表明，DLK1高表达均与较大获益相关(图5F)，而高DLK2组和低DLK2组的疗效相当(图5G)。
同时，作者观察到高Notch评分与舒尼替尼的高敏感性(图4G)和舒尼替尼一线治疗的长PFS之间存在关联(图5E)。进一步分析发现，在所有可获得的截止点，高Notch评分均与长PFS相关(图5H)。此外，与DLK2相比，DLK1的高表达与较短的PFS有更大的关联(图5I)。以上结果表明，高Notch评分与阿维鲁单抗联合阿昔替尼对舒尼替尼的有限益处相关，表明具有高Notch评分的ccRCC可能无法从VEGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）之外的额外ICI中获益。
Notch评分预测了纳武单抗优于依维莫司的益处
在CM-009/010/025队列中，作者计算了311例患者的Notch评分(图6A)，发现在来自JAVELIN队列训练集的截断值(第64.7百分位数)，交互效应显著(图6B)。在低Notch评分亚组而非高Notch评分亚组中，纳武利尤单抗比依维莫司带来了显著的PFS获益(图6C)。此外，作者观察到DLK1(而非DLK2)的高表达与较高的治疗获益相关(图6D和6E)，这与之前在JAVELIN队列中描述的结果一致(图5F和5G)。这些发现揭示了Notch评分高与纳武利尤单抗与依维莫司相比获益有限之间的关系。以上结果表明，与VEGFR/mTOR抑制剂相比，基于ICIs的免疫治疗可能被推荐用于Notch激活的ccRCC。
研究总结：
该研究首次发现Notch通路基因在ccRCC的重要作用，而构建的基于Notch激活的Notch评分可很好预测ccRCC患者对VEGFR/mTOR抑制剂的敏感性以及对ICIs的获益。基于TCGA-KIRC转录组数据，作者观察到与正常肾组织相比，大多数Notch通路基因在肾透明细胞癌中有差异表达。根据Notch通路基因的mRNA表达，作者将ccRCC样本分为3簇：mRNA簇A、mRNA簇和mRNA簇C，发现他们在免疫特征和预后方面显著不同。作者通过构建代表Notch激活的Notch评分，并在三个独立队列中观察到低Notch评分与VEGF和PI3K-AKT-mTOR通路的失活以及炎症TIME之间的关联。此外，在JAVELIN和CM-009/010/025试验中，Notch评分可能预示ccRCC细胞系对VEGFR/mTOR抑制剂的不良敏感性，以及基于ICIs的VEGFR/mTOR抑制剂免疫治疗的显著获益。总之，该研究为Notch激活或失活用于预测实体肿瘤中的免疫治获益具有重要意义。
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