免疫浸润分析在生信论文中可以算是一道“虎系菜”，重要性不言而喻。今天的小编为大家带来发表在Trends in Cancer上的一篇综述，“Turning Cold into Hot: Firing up the Tumor Microenvironment”。
介绍
免疫是人体的一种生理功能，人体通过免疫识别“自己”和“非己”成分，破坏和清除抗原物质。人体免疫系统有3道屏障，防御，清除致病微生物（图1）。肿瘤组织既起源于正常人体细胞，又异于原有组织细胞。肿瘤免疫微环境 (tumor microenvironment, TME)的提出，将肿瘤原发灶中复杂的细胞分子交互概览为一种现象。TME对肿瘤细胞产生获得性特征起到了关键作用（详见：癌症的标志）。在TME的选择下，肿瘤细胞获得了多种特征，帮助肿瘤细胞免疫逃逸。
图1 人体3道免疫屏障
正文解读
Exploring the TME
探索TME
在鉴定肿瘤细胞发生、进展的基因的努力从未停止过。癌细胞内基因的异常表达增强了肿瘤的侵袭性。TME也为肿瘤细胞的进化提供了支持1。TME高度异质性是近年来对肿瘤免疫治疗疗效参差不齐的主要解释。不同癌症中不同群体的TME可以划分多种亚型。Infiltrated-excluded (I-E) TME中，CTLs无法靠近肿瘤细胞的核心；Infiltrated-inflamed (I-I) TME中，肿瘤细胞高表达PDL1, CTLs高表达Grzb, IFNγ and PD-1；Tertiary lymphoid structures (TLSs) TME中，浸润多种免疫淋巴细胞，如Treg。图2
图2 TME分型
在分型之上，TME仍然广泛存在具有抑制免疫清除作用的免疫细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、骨髓源性抑制细胞(MDSCs)、调节性T细胞(Treg)等，TME的氧气水平、营养物质(葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等)、代谢产物以及pH值为孵育这样的细胞趋于异常。
在抗肿瘤治疗的过程中，来自体外的干预措施，在一定程度上影响了原有TME的动态平衡。评价治疗对肿瘤的生物学过程的影响时，需要考虑TME在治疗过程中的改变。调控TME的关键机制被发觉后，或许可对抗肿瘤治疗起到增益的效果。小分子生物靶向制剂可以精准调控关键的信号通路，这些通路参与了肿瘤的侵袭及转移。TME中的成分存在众多具有潜力的靶点。作者综述了TME的异质性(细胞组成、比例和激活状态)，将多个生物过程列为TME的调节枢纽。
Understanding the Complexity and Heterogeneity of the TME: ‘Cold’ versus ‘Hot’
TME的异质性，“冷”或“热‘？
TME中免疫细胞的浸润丰度与癌症预后和治疗效果的密切相关。因此，了解原发TME和转移性TME免疫细胞的不同组成可能是影响不同免疫治疗策略的一个重要因素。并且，即使患有同样的癌症，不同患者TME内的免疫细胞组成成分也有差异。前有研究绘制了结肠癌TME免疫浸润景观，对TME中非特异性免疫细胞和适应性免疫细胞的转录本进行分析，发现随着肿瘤分期的改变，TME的免疫景观随之迁移，并且与患者的预后存在相关性，另外趋化因子CXCL13 与白介素IL21形成趋化因子轴，与Tfh/B细胞浸润丰度及患者的预后相关2。在部分实体肿瘤晚期患者中，TME表现出一种炎症性T细胞浸润的亚型，其特点表现为：肿瘤抗原能够被癌症病人T细胞识别。基于这一靶向关系，过继T细胞治疗有望成为此亚型患者的新型免疫治疗方式3。响应ICB治疗的肿瘤经实验验证发现，与验证相关的分析信号通路激活，如STAT1和toll样受体3 (TLR3)信号的上调，白细胞介素10 (IL-10)信号的下调，ICB（免疫检查点抑制剂）治疗有效的肿瘤内观察到浸润更多的自然杀伤细胞4。致病微生物感染后，非特异性免疫中的信号通路发挥了重要调节作用。研究发现非特异性免疫中一些识别机制异常，会降低T细胞对ICB的反应5。因此，提高ICB效果的方案都集中在将非炎症的冷肿瘤转化为热肿瘤，期望肿瘤患者可以获得更好的免疫治疗反应。
冷热肿瘤转化的方案已经有了初步的探索，例如，放射治疗与ICB协同作用，治疗后的 TME内CD8 +T细胞浸润增加，Treg细胞减少6。此外，集落刺激因子(CSF)-1受体抑制剂靶向TAMs；白细胞介素(IL)-12，阻断细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA)-4等。
Novel Technologies to Understand the Complexity and Heterogeneity of the TME
分析TME的相关技术介绍
Mass Cytometry(imaging)
是一种基于重金属同位素标记的抗体，克服了传统荧光色素共轭抗体光谱重叠的限制，能够对多种细胞类型进行高维、单细胞分析，并可以深入分析TME内免疫浸润的功能状态。。
Single-Cell Transcriptomics
RNA seq极大地促进了我们对TME异质性的理解。scRNA-seq在多种癌症中具有特异性，包括黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、肝脏、肾脏、肺部以及头颈部癌。scRNA-seq在识别新的免疫亚群或特定细胞类型的独特功能状态方面具有强大的功能。
Single-Cell Epigenomics单细胞表观基因组学
探索TME中细胞的表观遗传(DNA或组蛋白修饰)。使用scATAC-seq确定肿瘤组织中所有单个细胞的全基因组表观遗传提供了一个强有力的工具。
(Single-Cell) Metabolomics/Proteomics
与DNA和RNA不同，代谢物不能被扩增。因此，(Single-Cell) Metabolomics/Proteomics
检测灵敏度低、分析容量有限，单细胞代谢组学仍处于起步阶段，远远落后于其他组学技术，需要继续努力以获得更高的通量和基于质谱(MS)的单细胞代谢组学定量能力。
图3. Systems Immunology Approaches to Understand the tumor microenvironment (TME)
Therapeutically Exploiting the TME to Boost Antitumor Immunity
基于TME开发新的靶向治疗
在2010年版的hallmarkers of cancer中，肿瘤细胞的另一个获得性特征是躲避免疫攻击。
免疫监视概念早在1909年由Ehrlich最先提出，认为机体中经常会出现的肿瘤细胞可被免疫系统所识别，作为异物而加以清除。50年后，Thomas通过对机体细胞免疫进化机制的研究．提出了肿瘤细胞抗原表达低下或机体细胞免疫功能受损是发生肿瘤的重要因素。随后，Burnet丰富了这一观点，创立了免疫监视理论(immune surveillance theory)，认为机体的免疫系统可以发挥监视作用，识别并消灭任何表达新抗原的“异己”成分或突变细胞，以保持机体内环境的稳定。当机体免疫监视功能低下，无法有效清除“异己”成分或突变细胞时，就可能发生肿瘤。
作者本段，对TME的塑造展开了讨论，尤其对非特异性免疫的免疫识别机制，致癌信号通路中的突变事件，细胞代谢，和表观遗传调控中潜在提高免疫治疗效果的靶点展开叙述。
图4 Heating up the TME allows more effective antitumor immunity.
Dendritic Cell (DC)–T Cell Functional Interplay Is Key for Productive Antitumor Immunity
DC细胞与T细胞交互
DCs细胞，是功能最强的抗原提呈细胞，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成。大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8+ T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是DC作为免疫治疗手段的基础。DCs同样有着独特分型，包括浆细胞样DC (pDCs)，CD11c + DC (cDCs)，交叉提呈CD8α +或CD103 +DCs。CD8α +DC细胞的生长发育受碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白3 (BATF3)的调控。趋化因子CXC配体9(CXCL9)和CXCL10是招募表达CXC受体(CXCR3)的CD8 T细胞进入肿瘤所需的两个关键趋化因子。CXCL9和CXCL10的主要表达于CD103 + DC, CD103 +DC功能障碍或BATF3的缺失导致T细胞在进入肿瘤的转运过程受阻和抗肿瘤反应的缺陷7。另外，在黑色素瘤患者中，这种BATF3调控的DC细胞的基因与CXCL9/10的表达和效应T细胞相关基因之间存在相关性，这突出了CD103 + DC驱动CXCL9-、CXCL10-、 CXCR3-表达的CD8 T细胞对效应T细胞浸润TME的重要性。
此外，肿瘤细胞特意趋动的趋化因子CC配体5(CCL5)也对T细胞向TME的有效浸润至关重要，CCL5也可被骨髓细胞分泌的CXCL9扩增8。重要的是，在小鼠黑素瘤模型中，使用肿瘤抗原与XCL1融合蛋白，靶向交叉提呈XCR1 + CD8α + DC细胞后，可以增加抗原特异性CD8 T细胞浸润，并控制肿瘤生长9研究由报道，DC细胞与T细胞之间的细胞交互，对依赖αPD1介导的抗肿瘤免疫至关重要。在接受αPD-1制剂小鼠肿瘤模型中，CXCL9/CXCR3信号轴的变化与CD8 T细胞响应程度相关。这种效应不是由于CD8 T细胞浸润肿瘤组织障碍，而是因为CXCR3可以促进TME中的DC细胞与T细胞相互作用，从而产生抗肿瘤反应10。αPD-1介导的抗肿瘤反应需要IL-12的DC细胞参与，而DC细胞可以识别激活的CD8 T细胞所表达的interferon (IFN)γ11。这些研究发现DC 细胞与T细胞交互，如CXCL9/10 CXCR3轴，是产生有效抗肿瘤T细胞免疫的关键。
Innate Immune-Sensing Machinery
非特异性免疫的作用
恰当的激活TME中非特异性免疫细胞的识别机制 (innate-sensing) 可以提高T细胞的抗肿瘤细胞作用5。肿瘤细胞内部可被免疫细胞识别的成分的变化，可以将细胞癌变及转型的信号转递到TME中。c-GAS/STING 信号通路 (cyclic GMP–AMP synthase, stimulator of IFN gene) 是关键的胞质DNA监视器，参与了I型IFN的产生，DC细胞的激活，以及肿瘤相关抗原激活CD8 T细胞的过程12,13。cGAS可以被侵入细胞的病毒和细菌DNA以及异常定位在胞浆中的线粒体DNA和自体DNA激活，活化的cGAS以ATP和GTP为底物，催化形成2‘，3’环化GMP-AMP（2’，3’-cGAMP）（也称为“非经典”cGAMP），这是一种环二核苷酸（CDN），作为第二信使与定位于内质网膜上的接头蛋白STING结合。当STING通过cGAS依赖性或非依赖性方式被激活后，STING会向高尔基体易位，并在易位过程中招募并激活TBK1，进而导致IRF3、NF-κB和STAT6的磷酸化和核转位，导致干扰素和其他炎症基因的表达增加。在结肠、皮肤、乳房等恶性肿瘤模型中，在肿瘤组织给予cGAMP和其他STING激动剂可显著降低肿瘤生长14。瘤内给药STING激动剂联合ICB是对肿瘤免疫治疗的新尝试。癌细胞胞质内的DNA含量丰富，通过增加由辐射引起的DNA损伤，不会增加I型IFN的含量。DC细胞中cGAS/STING通路通过调节I型IFN的产生起到清除因辐射诱导的肿瘤作用15。cGAS对肿瘤细胞呈现免疫原性和热性至关重要，肿瘤细胞来源的cGAMP可通过缝隙连接传递至TAMs细胞或DC细胞，STING激活，表达I型IFN，促进CD8 T细胞向肿瘤浸润16。Demaria et al17 通过瘤内给予cGAMP起到清除转移肺癌的小鼠模型瘤灶的作用。同时他们发现肿瘤组织表达IFN-β的细胞，过表达CD31过表达，下调CD45。这说明外源性STING激动剂也可促进CD8 T细胞向TME浸润。结肠癌和乳腺癌的内皮细胞中的STING表达与CD8 T细胞浸润和预后呈正相关18。
BRCA1蛋白功能缺失的细胞，在DNA损伤后不能G2细胞周期停止增殖。在BRCA 2缺陷细胞中，DNA损伤引起干扰素刺激基因 (ISGs) 过表达，以及cGAS/ sting介导的IFN反应过度激活。奥拉帕尼可增幅此类IFN反应。此外，肿瘤细胞中BRCA2的缺失也导致了TNFα的敏感性增强。但是因BRCA1或BRCA2缺失引起的活跃DNA损伤检查机制活跃和高水平的促炎细胞因子是否可以诱导产生更多的趋化因子，从而驱动招募更多的肿瘤抗原特异性CD8 T细胞浸润到TME，还有待进一步的研究。同样，肿瘤细胞中RNA编辑酶ADAR1的功能缺陷使肿瘤对免疫治疗更加敏感，并克服了对检查点封锁[35]的抵抗。研究发现，与野生型对照物相比，ADAR1缺陷的黑色素瘤中CD8 T细胞浸润显著增加，TAMs细胞和MDSCs细胞比例显著降低。机制上，ADAR1缺失导致大量RNA片段积累，dsRNA检测器MDA5是提高炎症水平和免疫浸润所必需的19。
(Oncogenic) Signaling from Cancer Cells to the TME
肿瘤信号通路与TME的关系
TME中，关注肿瘤细胞内在信号通路变化与T细胞的排斥或浸润的关系是一种新治疗策略。Spranger et al.证明了黑素瘤中β-catenin激活的增强导致T细胞排斥，指出黑素瘤细胞固有的致癌途径可能通过调节DC激活来影响T细胞向TME浸润20。
黑色素瘤细胞中解偶联蛋白2(UCP2)表达增加与T细胞激活相关基因表达相关。UCP2在黑色素瘤细胞中的过表达导致了炎症性TME的形成，UCP2激活表达BATF3的DCs细胞和增强CD8 T细胞向肿瘤部位的浸润21。小鼠黑色素瘤模型试验发现，BRAF抑制剂PLX4720使TME向免疫活跃状态转化，Treg和CD11b + Gr1 + 髓系细胞数量下降，表达CD40L 和IFNγ的CD4 T 细胞浸润增加。另外，抗肿瘤药物的“旧药新用”也逐渐引起关注。细胞周期素依赖性激酶4/6 (CDK4/6) 的抑制剂不仅可以阻断细胞周期进程，还影响肿瘤抗原递呈和TME的调节，CDK4/6抑制剂显著抑制TME中Treg细胞增殖22。
Metabolic Cues: from Immune Escape to TME Modulation
代谢组学与TME
与肿瘤细胞一样，效应T细胞依赖糖酵解支持细胞增殖，发挥功能，而naïve和记忆T细胞主要通过线粒体呼吸来获能23。TME内产生的某些代谢产物可能会抑制抗肿瘤免疫。因此，了解TME内肿瘤细胞与其他细胞成分之间的代谢途径的信号交互具有重要的治疗价值。在低葡萄糖和低氧环境下会导致肿瘤细胞表面MHC-I表达下降。机制研究发现STAT1激活受损和(PI3K)/AKT信号通路激活是其驱动因素24。因此，抑制PI3K信号通路除了抑制细胞增殖外，还可能通过干扰肿瘤细胞的免疫逃逸过程24。交叉提呈是DC细胞的功能特征，胞内脂质的蓄积下调了MHC I复合物，影响了该功能25。
内质网应激可传递到线粒体，引起线粒体功能障碍。未折叠蛋白或氧化蛋白的积累会引发严重的内质网应激，mtROS生成增多，导致CD8 T细胞的线粒体活性缺陷。PERK在内质网应激的信号通路中起到关键的传递作用，在unfolded protein response (UPR)通路激活。无论是基因层面的抑制还是药物抑制PERK，都可以降低CD8 T细胞中mtROS的减少，提供有效的抗肿瘤T细胞免疫26。在产生耗竭表型的肿瘤抗原特异性T细胞中存在高ROS含量的破碎线粒体，促进线粒体生成可以在一定程度上修复T细胞的功能。
Ferroptosis in the Cancer–Immunity Cycle
铁死亡与肿瘤免疫循环
T细胞可通过多种机制诱导肿瘤细胞死亡。例如，T细胞可以通过释放穿孔素或颗粒酶杀死目标，或通过Fas配体介导的细胞凋亡。释放IFNγ的CD8 T细胞通过下调谷氨酸胱氨酸反向转运体SLC3A2和SLC7A11的两个主要亚基，促进肿瘤细胞发生铁死亡过程。重组干扰素γ可减少疫缺陷小鼠的肿瘤负荷，而这种抗肿瘤作用可被铁死亡抑制剂liproxstatin-1阻断27。
Epigenetic Modulation of Immune Escape and the TME
免疫逃逸
表观遗传修饰，包括DNA甲基化和染色质重塑。在逃避免疫监视的机制中，癌细胞通常通过表观遗传沉默MHC或其他抗原呈递机制、细胞因子或趋化因子的关键成分来下调免疫监视。抑制DNA甲基转移酶(DNMTs)可以通过上调肿瘤特异性CD8 T细胞表面MHC-I的表达和产生更多的IFNγ来增加肿瘤的免疫原性和T细胞的免疫识别能力28。
组蛋白甲基化和乙酰化可以改变染色质结构和调节基因转录，从而决定细胞的分化和功能。在小鼠黑色素瘤细胞中，消除组蛋白去甲基化酶LSD1，导致大部分MHC-I编码基因上调，表明抑制LSD1可以增强肿瘤免疫原性，导致CD8 T细胞浸润和抗肿瘤免疫增强。抑制EZH2显著增加肿瘤产生CXCL10，抑制DNMT1介导的DNA甲基化促进CXCL9和CXCL10 mRNA和蛋白的表达。因此，靶向抑制EZH2和DNMT1可增强效应T细胞向TME的浸润，抑制肿瘤进展29。抑制Treg细胞中EZH2的活性后，Treg细胞的促炎基因明显表达增加，促使CD4和CD8 T细胞进入TME增加抗肿瘤免疫30。另外，使用EZH2抑制剂GSK126可导致TME内MDSC积累增加，CD4和IFNγ + CD8 T细胞减少。
CD8 T细胞在急性感染时分化为效应细胞或记忆细胞，在慢性感染或TME时分化为衰竭细胞[44,66 69]。事实上，效应因子、记忆或耗尽表型的获得与染色质可及性的稳定变化有关，这与naïve T细胞状态不同[67]。值得注意的是，进一步分化为记忆细胞的记忆前体效应细胞确实获得了效应功能，这是由经典定义的效应分子位点的去甲基化所表明的。这一发现清楚地表明，记忆T细胞是由效应细胞通过脱分化产生的，而不是直接来自naïve T细胞[66]。T细胞特异性DNMT3A缺失导致DNA甲基化减少，记忆T细胞形成加速，这是由于记忆相关基因的快速重新表达[66]。EZH2还能促进CD8 T细胞记忆前体的扩展和向功能性记忆细胞的分化，并通过激活Id3而沉默Id2和Prdm1来增强其抗肿瘤活性[70]。
Oncolytic Virus (OV) to Inflame the TME
溶瘤病毒
溶瘤病毒(OV)可以将非炎症的TME转化为炎症的TME，并引发强烈的抗肿瘤免疫反应。例如，OV诱导的肿瘤细胞裂解导致肿瘤相关抗原/新抗原的释放，以及通过DAMPs和PAMPs引发炎症免疫反应。
Concluding Remarks
结语
我们现在认识到，TME是一个动态的网络，存在众多的可调控环节，其中通过单细胞测序，多组学联合分析，可以揭示更多TME的特征，对开发新的抗肿瘤策略，增强免疫治疗的药物提供了更多的思路。
TME研究延伸课题生信分析意向表 (mikecrm.com)
小编有话讲
在生信研究中，小编对免疫浸润分析仅仅停留在相关性分析。然而免疫浸润分析不仅仅限于分子分型以及计算免疫细胞的含量，不仅技术上的屏障有待突破，多组学之间联系也需要更多的探索。看完这篇综述后有了很大的启发，为大家解读本文的同时，小编也积累了很多关键词，关键信息。最近也在设计课题，着实薅了一把灵感。希望也能为各位研友提供一线索哦~
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