DNA 组装（Assembly）

DNA Assembly是分子克隆（Molecular cloning，即核酸片段的in vivo增殖）中不可或缺的步骤。它将目标核酸序列引入微生物体的载体（Vector）中，通常充当vector的是细菌的质粒

质粒（Plasmid）

• 质粒是除基因组之外的环状DNA，是微生物的交流工具
• 易于储存、提取和转化，是基因工程的载体
• 大小在几k到十几k，最大达200k

细菌的染色体与质粒

质粒的结构

质粒由三个部分组成：复制起始位点（Origin）、AB（抗生素）Resistance、多克隆位点（MCS）。其中 AB Resistance 用于表达抗生素抗性蛋白，用于筛选成功转入质粒的细菌。MCS用于组装目标基因：商业化质粒的MCS往往含有多种Restriction site且每个位点唯一

一个用于分子克隆的质粒的典型结构

DNA的连接（ligation）

DNA连接酶（ligase）可将缺口（nick，即断裂的磷酸二酯键）修复连接。而裂口（gap，有碱基的缺失）则首先需要DNA Polymerase的活性，最后DNA ligase修补nick

DNA连接酶活性

DNA的限制性酶切（Ristricted Digestion）

• Ristricted指酶切具有特定的识别位点（Restriction Site）
• 末端：粘末端（可互补配对），分为5'粘末端与3'粘末端

酶切后不同的DNA末端

• 来源：细菌抵御来自噬菌体等的外源性DNA时会将其切断。 a）若切割某一固定位点，为限制性内切酶(ristricted endonuclease）（自身序列往往很少含有此类内切酶的酶切位点，或即使含有，也受到甲基化保护，以防止自身DNA受到切割） b）若切割位点与给定外源DNA序列有关，则为CRISPER

标准化组装

标准化组装试图解决MCS只能组装一个DNA片段的缺陷。其方法有两种

1. 每次组装一个片段，可重复组装（以Biobrick Assembly为代表）
2. 一次组装多个片段（以Golden Gate为代表）

SLIC组装

SLIC（Sequence and Ligation independent cloning）发明于2007年，是一种一次组装多个片段的组装方法。SLIC在目标片段上构造overlap，并使得overlap形成互补的粘末端

SLIC组装

• 首先设计PCR引物，使得DNA片段拥有相邻片段的端部序列
• 利用T4 DNA Polymerase的3'端外切活性形成DNA片段的粘性末端。粘性部分的长度由反应时间粗略控制
• 退火，粘末端互补，利用DNA Polymerase 和 DNA Ligase修补gap

缺点：无法应用与较短片段的连接（3'端外切无法准确控制长度）。Polymerase补全gap时容易引入错误

Gibson组装

Gibson组装的基本思想与SLIC无异，也是一种利用overlap的拼接策略。其改进之处在于将外切、聚合、连接集中于一个反应之中。

2010年，Venter实验室发表了人造生命Synthia的合成，其第一作者Gibson以自己的名字命名并发表了这种DNA组装方式。正是这种新颖的组装方式帮助人类造出了第一例完全携带人造DNA的生命体

典型protocal的反应溶液包括T5 exonuclease、Phusion polymerase与Taq ligase。5'外切酶首先将DNA片段的3'末端暴露，随后粘末端互补，phusion聚合酶的聚合作用快于exonuclease的外切活性，最终追及形成nick，由Taq ligase补全

Gibson组装

Golden Gate组装

Golden Gate组装是一种利用限制性内切酶进行一次多个片段组装的策略。它使用了一种与众不同的限制性内切酶——BsaI，其识别序列与酶切序列不在同一位置

BsaI的Restriction site

限制性内切酶BsaI提供了这样两个特性：1.酶切后的粘末端可以人为设计 2.切口两侧仅有一侧拥有酶切位点。利用前一个特性，可以指定多个片段相互连接的先后顺序。利用后一个特性，可以保证在酶切活性的环境中，仅有正确连接的片段能保存完整，而错误连接的片段会再次被酶切

以两个片段的Golden Gate组装为例。Vector质粒提供载体，而Target质粒提供目标片段。将Vector的BsaI识别区域设计在内内侧，而将Target的BsaI设别区域设计在外侧（如图）。如此仅有正确连接（Vector + Target）的质粒不含有BsaI识别位点

Golden Gate组装的Restriction site设计

将设计好的片段与BsaI、ligase混合在高温（37℃）与低温（16℃）之间迭代数次。高温有利酶切而低温有利连接，每次迭代会导致未连接或连接回原质粒的片段再次遭到酶切，从而以更大的概率保留正确组装的质粒。最后以55℃加热，有利于酶切且ligase失活，尽可能排除错误的组装

Golden Gate组装的典型protocal

BioBrick组装

BioBrick是最早提出的DNA标准化组装策略，是iGEM竞赛中最常用的组装策略。2004年由MIT提出

同尾酶（isocaudomer）指识别序列不同而酶切后粘末端相同的序列，如XbaI与SpeI。其粘末端在退火后互补，但互补后的片段不再含有酶切位点

BioBrick所使用的两组酶切位点，其中XbaI与SpeI是为尾酶

利用一组同尾酶和另外两个酶切位点（EcoRI、PstI），BioBrick实现了可重复的、顺序性的DNA拼接。例如，将A片段拼接在B片段之前，则首先将A质粒用E与S酶切，将B质粒用E与X酶切。分别PCR扩增目标序列，随后将二者混合，退火并连接即可。连接后的质粒仍然带有EX/SP前缀与后缀，因此仍是一个可以继续连接组件的BioBrick元件

BioBrick组装策略

BioBrick组装会在序列之间留下一段8bp的疤痕（scar），导致ORF的移动，影响了融合蛋白（fusion protein）的表达。2008年提出的BB-2策略修改了酶切位点，使得Scar变为6bp

BB-2组装策略

另一种改进策略将BioBrick的同尾酶替换为BgI II与BamH I。这对同尾酶产生的scar可被翻译为短蛋白linker从而应用于fusion protein

LCR（Ligase Cycling Reaction）组装

LCR的思路与PCR有些相似。LCR是一种比较暴力的，基于耐热ligase的DNA组装方法，发明于2016年。同PCR一样，LCR也要求首先一段单链“引物”，只不过在LCR中这段引物同时和两段DNA片段互补，成为单链桥接寡核苷酸（single strand bridging oligo）。高温下DNA变形后有一定几率恰好同时与此LCR引物结合，退火后耐热ligase修补缺口。经过多个循环，大量的DNA片段在bridging oligos的引导下被ligase连接

LCR组装

此方法可应用于在长片段、多片段的连接中正确率相比传统方法更高，但成功率一般