2023年11月22日，中国农业大学任发政院士/郭慧媛教授团队和首都医科大学附属北京安贞医院张宏家/姜文剑教授团队合作在European Heart Journal发表了题为“The activator protein-1 complex governs a vascular degenerative transcriptional programme in smooth muscle cells to trigger aortic dissection and rupture”的研究论文，绘制了主动脉夹层（AD）进展过程中人升主动脉的细胞图谱，揭示AP-1调控平滑肌表型转换和AD发病进程的作用机制。该研究中的单细胞测序及数据分析服务由百奥智汇提供。
一、研 究 背 景
主动脉夹层（AD）是一种退行性主动脉重塑疾病，由于缺乏有效的治疗药物，其死亡率极高。中膜内壁的平滑肌细胞（SMCs）会呈现一系列状态，它们从收缩表型到合成表型的转变从根本上触发了AD。然而，控制这一转变和随后发生主动脉夹层的潜在病理机制，仍然难以捉摸，特别是在不同的疾病阶段。
二、研 究 方 法
对9名接受升主动脉置换术的患者（包括4名急性患者、3名亚急性患者和2名慢性患者）和5名接受心脏移植患者的升主动脉进行了单细胞RNA测序。通过轨迹推断、功能评分、SCENIC和相互作用分析来鉴定控制SMC表型转换的致病靶标，并通过细胞实验、小鼠模型实验进行验证。
三、研 究 结 果
01 单细胞测序鉴定出人类主动脉中一种新兴的合成型平滑肌细胞亚群
单细胞测序共得到93,397个高质量单细胞数据，将28个样本的数据整合后进行分群和细胞类型注释，共鉴定出12个细胞亚群，包括内皮细胞（ECs）、平滑肌细胞（SMCs）、成纤维细胞、合成型平滑肌细胞、间充质细胞、增殖细胞、髓系细胞、纤维样巨噬细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞和NK细胞，并通过GO分析，确定了分群的准确性。将所有数据分为对照组和AD实验组，结果表明，在实验组人类主动脉中有一种新兴的合成型SMCs，通过对比合成型SMCs与所有主动脉细胞的比例，进一步证明了该亚群在AD中的增加。
02 合成型SMCs可能的起源和特征
SMC从收缩表型到合成表型的转变是导致主动脉变性和夹层的关键事件。为了探究合成型SMCs的潜在起源和病理特征，作者对所有的非免疫细胞进行了重新聚类，得到17个亚群，包括4个SMC亚群。其中，收缩型SMCs表达经典的收缩相关基因，而其他3个亚群收缩基因表达量相对较低。合成型SMCs又被分为3个亚型：纤维样SMCs、脂肪样SMCs和纤维肌细胞。由于合成型SMCs高表达典型的合成基因，而收缩相关基因低表达，因此，这可能反映了在AD中存在从收缩到合成型的转变，并通过进一步分析证明。细胞比例分析表明，收缩型SMCs在AD中占比显著降低，而合成型SMCs比例显著升高；相似性分析表明，在所有血管细胞亚群中，合成型上调表达的基因与SMCs的特征基因最相似；轨迹推断分析表明，收缩型SMCs是3个合成型SMCs的起源。
03 AD不同疾病阶段的特异性表型转换及机制探究
AD的不同疾病阶段显示出不同的病理特征。急性和亚急性组中分离出的收缩型SMCs收缩基因表达评分低于慢性组，而合成型SMCs的合成基因表达评分高于慢性组；急性和亚急性AD中的表型转换评分和合成型SMCs的相对细胞数量都比慢性AD高，表明不同疾病阶段拥有特异的表型转换特征。拟合曲线分析表明AD中存在疾病阶段特异性的细胞外基质重塑。此外，通过对人升主动脉样本的分析，进一步证明急性和亚急性AD中收缩相关基因表达下调，合成基因表达上调。以上分析都表明AD中存在疾病阶段特异的表型转换。
04 AP-1介导收缩型SMCs向纤维样SMCs和脂肪样SMCs的表型转换
作者通过对比收缩型SMCs和合成型SMCs的基因表达，筛选出两个亚群的差异表达基因，发现多个AP-1亚基，包括FOS、FOSB、JUN、JUNB和JUND。通过SCENIC分析发现，AP-1调控基因在纤维样平滑肌和脂肪样平滑肌中表达活跃，同时，在急性和亚急性AD中，AP-1随着发育轨迹表达量升高。接下来，作者通过ChIP实验证明，p-JUN特异性抗体可以结合在COL5A1、COL1A1、COL1A2和ApoE的启动子区。使用AP-1激活剂和抑制剂分别处理细胞，证明AP-1的升高和激活促进了AD中合成型SMC的扩增。
接下来，作者探究了促进AP-1介导的表型转换的上游调控因子。差异表达分析和通路分析表明，相比于纤维样平滑肌和脂肪样平滑肌，收缩型SMCs中ATP代谢过程和OXPHOS富集，进一步结合轨迹推断分析，提示OXPHOS可能负向调控合成型SMCs在AD中的扩增。作者用鱼藤酮和辅酶Q10处理细胞，证明了抑制OXPHOS可以激活AP-1。ChIP实验表明，鱼藤酮增强了p-JUN抗体与选定合成基因启动子区域内的推测位点的结合，而辅酶Q10则相反。以上结果都证明OXPHOS的缺陷作用于AP-1的上游，促进合成型SMC的扩增。
05 肿瘤坏死因子（TNF）触发OXPHOS—AP-1轴进而促进表型转换
AP-1对外部有丝分裂刺激有响应，因此，作者进一步探究了触发OXPHOS—AP-1介导的表型转换的细胞外信号。GO分析表明，纤维样平滑肌和脂肪样平滑肌中，与AP-1共表达的基因在多个TNF信号通路和ECM相关通路显著富集。细胞互作分析表明，急性和亚急性AD中，免疫细胞亚群和收缩型SMCs的TNF信号通路有明显的相互作用。通过TNF-α处理aoSMCs降低了ATP水平和膜电位等，而用辅酶Q10则恢复了这一作用，无论是与辅酶Q10还是AP-1抑制剂共同处理，都可以抑制TNF-α介导的收缩基因下调和合成基因升高。这些结果表明，TNF信号抑制了OXPHOS和随后的AP-1激活，从而促进了合成型SMCs的扩增。
进一步地，作者通过小鼠模型实验证明了以上结论，通过靶向AP-1抑制SMCs的表型转换，进而缓解AD。
四、研 究 结 论
本文通过单细胞测序，分析发现了AD中新兴的合成型SMCs亚群，并结合细胞实验和动物模型实验，证明了TNF信号可以通过抑制OXPHOS和随后的AP-1激活促进了合成型SMCs的扩增。通过靶向AP-1可以抑制SMCs的表型转换，进而缓解BAPN诱导的小鼠胸主动脉夹层。该研究为治疗人主动脉夹层提供了重要的科学依据。
本研究由中国农业大学和首都医科大学附属北京安贞医院合作完成。中国农业大学的罗永挺教授、罗俊杰教授、安鹏教授、赵文婷博士和首都医科大学附属北京安贞医院的赵远斐副研究员为本文的共同第一作者。中国农业大学任发政院士、郭慧媛教授以及首都医科大学附属北京安贞医院院长张宏家教授、心外科姜文剑教授为本文的共同通讯作者。
专 家 评 论
——日内瓦大学医学系心脏病学部Kapka Miteva教授
主动脉夹层（AD）是一种灾难性疾病，导致主动脉内膜层撕裂，造成内膜层和内膜层分离，引起主动脉壁内部和沿主动脉壁出血。AD是一种新出现的心血管疾病负担，具有很高的死亡风险。尽管手术和介入方法有所改进，但AD患者的死亡率和发病率仍然很高。目前，尚无预防、稳定或逆转 AD 的药物治疗方法。具有收缩表型的血管平滑肌细胞（vSMC）是主动脉介质的主要成分，负责维持血管张力。在损伤、血管炎症和氧化应激的作用下，血管平滑肌细胞会发生去分化、增殖、迁移，并减弱其收缩特性，形成一种合成表型，这是主动脉壁减弱的根本原因，也是导致病理性AD的原因之一。目前还没有直接针对 SMC表型转换的介质的疗法，而合成表型会促进主动脉瘤和AD的形成。揭示vSMC亚型的异质性和功能多样性、其转换过程以及控制这一过程的分子机制将促进该领域的研究进展。幸运的是，单细胞 RNA 测序技术（scRNA-seq）的发展为揭示细胞异质性和研究疾病机制带来了突破性进展。
正如本期European Heart Journal所报道的，利用scRNA-seq技术，罗永挺教授及其同事构建了不同AD进展阶段中人类升主动脉横断面单细胞转录组图谱，并发现了调控AD中vSMC表型转换的机制。在所有AD患者升主动脉中，发现了合成型SMC亚群，在急性和亚急性AD组中，AD相关vSMC合成表型的特征是疾病时间特异性细胞外基质（ECM）重塑和合成标志物（如蛋白酶和炎症因子）上调，AP-1的表达沿着发育轨迹持续升高。
AP-1是最早被发现的哺乳动物转录因子之一，在调节增殖、凋亡、分化、存活、细胞迁移和转化等多种细胞过程中具有重要功能，在癌症、纤维化、器官损伤和炎症性疾病等疾病中发挥着重要作用。此外，在本期European Heart Journal上，罗永挺教授等人发现，高血压是AD的一个主要风险因素，而高血压会导致AP-1在 AD 患者的合成血管内皮细胞中过度表达。一系列分析表明，肿瘤坏死因子（TNF）信号是抑制 OXPHOS 并随后触发 AP-1激活、促进合成纤维样vSMCs和脂肪样vSMC表型转换的原因。通过增强OXPHOS或抑制AP-1来靶向OXPHOS-AP-1轴，可提高AD小鼠模型的存活率并缓解 AD 的发展。因此，这项工作提供了对退行性主动脉重塑过渡过程的全面了解，为开发针对TNF—OXPHOS—AP-1轴的人类AD治疗方法铺平了道路，这是一种消除AD中合成vSMC表型转换的特定方法。
本研究在揭示AD中vSMC表型转换的机理调控方面取得了重大进展，并确定了抑制AP-1相关信号通路的选择性小分子，作为人类AD的可行治疗策略，进一步的临床转化工作仍是当务之急。
参考文献：
1. Luo, Yongting et al. “The activator protein-1 complex governs a vascular degenerative transcriptional programme in smooth muscle cells to trigger aortic dissection and rupture.” European heart journal, ehad534. 22 Nov. 2023, doi:10.1093/eurheartj/ehad534
2. Miteva, Kapka. “On target inhibition of vascular smooth muscle cell phenotypic transition underpins TNF-OXPHOS-AP-1 as a promising avenue for anti-remodelling interventions in aortic dissection and rupture.” European heart journal, ehad679. 24 Nov. 2023, doi:10.1093/eurheartj/ehad679
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