你要很清楚用于做引物的模板序列,其次要先对PCR目的序列的长度有个大致估计。
第一步：找到Primer3的站点。
第二步：贴上模板序列。
进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（如下图）在“Paste source sequence below (5′->3’…”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5′->3’方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。
第三步：重要参数设定。
首先是“Product Size Ranges ”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。第二个参数是“Primer Size”，默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。第三个参数是“Primer Tm ”这个和Primer Size差不多。
第四步：Pick primers：
点一下这个按钮，符合你大小预期的primer就出来了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还要primer本身的信息，包括位置，长度，Tm，GC含量，任何位置互补碱基数，3’端互补碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5′->3’），还要产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间3’端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。
比如：
WARNING: Left primer is unacceptable: High 3′ stability
OLIGO start len tm gc% any 3′ seq
LEFT PRIMER 1 33 69.02 45.45 6.00 1.00 TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCC
RIGHT PRIMER 1388 34 67.86 29.41 6.00 2.00 AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACAT
SEQUENCE SIZE: 1388
INCLUDED REGION SIZE: 1388
PRODUCT SIZE: 1388, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3′ COMPL: 3.00
第五步：引物设计检验：
可以仅仅设计一对引物，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是5′->3’）如果符合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物，最好都要检查一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源序列框中，并且通过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR，将另做说明。
Primer 3 在线引物设计工具
至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCR一次成功，也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果，但是不管怎么说，软件做引物可以让自己心中有数。
转载自丁香园，作者：bingsenxu
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