枯草杆菌(Bacillus subtilis)是一类好氧型革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤、水、动植物体表等各种生态环境。B.subtilis 可以通过形成孢子抵御干燥、营养缺乏等极端恶劣环境。B.subtilis 细胞壁成分简单,且不分泌对人和哺乳动物有害的内毒素脂多糖被美国食品和药物管理局授予通常认为安全的地位。
枯草芽孢杆菌重组蛋自表达系统的6大优势
1. 可以将蛋白释放到培养基中，方便其分离和纯化；
2. 被广泛用于工业酶的生产，因此在发酵技术方面是众所周知；
3. 多种多样的遗传工具可供选择，如B. subtilis 168 和 Ki-2等；
4. 枯草芽孢杆菌的基因组信息完整；
5. 枯草芽孢杆菌是非致病性的，不含内毒素，具有“公认安全”（GRAS）的地位；
6. 无密码子偏好性
因此，B.subtilis是重组蛋白生产的优良宿主，已作为一个微生物细胞工厂被广泛应用于食品、纺织、医药、生物防治、水产养殖等领域。
枯草芽孢杆菌重组蛋自表达系统存在的问题
1. 野生菌自然感受态能力弱，遗传操作困难；
2. 胞外蛋白酶的分泌影响胞外重组蛋白产量；
3. 质粒的不稳定性和抗性基因的不安全性；
4. 染色体整合下，重组蛋白的表达水平无法与多拷贝质粒表达相比。
1. 提高芽孢杆菌重组蛋白分泌的策略
1.1 改造启动子
启动子类型与特点：按照诱导机制的不同， 启动子可分为组成型启动子， 诱导型启动子和自诱导型启动子。
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以下是从文献中摘录的句子：
PHpaII is a widely used promoter from Staphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌）.
The promoters P43 and PAprE are both strong and constitutively expressed promoters in B. subtilis.
PAmyL is the native promoter of a-amylase from B.licheniformis.
Promoter Pylb：stationary phase-dependent promoter Pylb :稳定期依赖启动子Pylb
Only four promoters (cry3Aa [26], amyQ [44], aprE [45] and a hybrid promoter [46] consist of
P43 [9], Pylb [29] and Prha [47] were integrated to express single-copy gene.
The promoters PHpaII (Westers et al. 2006),P43 (Zhang et al. 2014) and PAprE (Jan et al. 2001)
have been claimed to bring about high levels of proteinsecretion.
The engineered promoter NBP3510 was sufficient for efficient chromosomally
integrated intracellular expression.
α -amylase promoter (PamyQ)
1.2 信号肽
信号肽跨细胞质膜运输的蛋白一般具有 N端信号肽，信号肽含有三个不同的区域：带正电荷的 N 末端结构域、疏水核心区域以及 C末端区域。信号肽由短的氨基酸组成，并在蛋白正确运输到目的地后被特异性信号肽酶和信号肽肽酶去除和降解。信号肽的疏水性是早期蛋白分泌的关键因素。为方便选择信号肽，研究人员开发了信号肽预测工具 SignalP。为优化异源蛋白分泌，Brockmeier 等通过高通量筛选方法构建了一个 SP 文库，用于筛选每种分泌的异源蛋白的最佳信号肽。
1.3 宿主的改造
为什么很多进行分泌蛋白表达的研究都能成功实现，注意看他们采用的菌株，都是经过多重改造后的，比如下图的SCK6、PB8菌株：
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B. subtilis WB600, which is deficient in six extracellular proteases due to knockouts of the nprB, nprE, aprE, mpr, bpr and epr genes.
除转录、翻译及分泌水平外，性状优良的芽孢杆菌表达宿主也是实验和工业生产不可或缺的一部分。宿主的改造主要通过以下三个方面:
(1)构建蛋白酶缺陷菌株。B.subrilis 产生至少8种细胞外蛋白酶，细胞外蛋白酶具有降解异源分泌蛋白的
能力，导致重组蛋白的损失。为解决这个问题，在 B. subtilis 168 的基础上，一系列蛋白酶突变菌株如 1A751，
WB600和WB800等被成功构建。
(2)非必需基因组删除。非必须基因组的删除可以实现宿主代谢效率的提高，减少代谢冗余、增加重组蛋白产量和
降低副产物代谢途径等作用。在B.subtilis中，Manabe 等人将菌株 MBG874 删除 20%的基因组后，与野生型细胞
相比，突变菌株纤维素酶和蛋白酶显着增强，具有工业应用价值。
(3)全局代谢调控。如平衡宿主碳、氮代谢网络、过表达分子伴侣、敲除影响蛋白翻译及分泌的基因等。
除转录和翻译外，翻译后蛋白的折叠与分泌同样对重组蛋白产量有一定的影响。
dlt 操纵子介导脂磷壁酸的 d-酰化，相关研究报道，4dl 能改变细胞膜表面电荷环境使重组蛋白分泌增强，而PrsA是一种分子伴侣[79.80]，有助于折Sec系统分泌的蛋白。
1.3.1 制备超级感受态
芽孢杆菌难以转化外源的DNA，研究发现“ComK of B. subtilis is the master regulator for competence development(Mironczuk et al. 2008; Zhang and Zhang 2011).”
ComK 是枯草芽孢杆菌中调控感受态形成的关键转录因子，其浓度的改变会调控细胞形态变化、外源DNA 吸收等相关的感受态发育后期基因的表达，并容易使细胞进入感受态状态。因此，张晓舟等在枯草芽孢杆菌1A751 基因组中整合了comK 基因获得菌株SCK6，通过木糖诱导的启动子PxylA诱导ComK 的表达，从而制备出SCK6的高效感受态。
lacA::PxylA-comK:xylose-inducible promoter PxylA：木糖诱导型启动子PxylA
文献：
- Transformation of Bacillus subtilis
- Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis
1.3.2 感受态培养基
制备感受态需要特有的培养基配方：
10 mLGM I：1 mL 10 x Spizizen salts，0.1 mL 10%酵母粉，0.25 mL 20%葡萄糖，0.2 mL 1%水解酪蛋白，
0.2 mL 0.25%所需氨基酸，补充灭菌蒸馏水至总体积10 mL。
10 mL GM II： 1 mL 10 x Spizizen salts，0.05 ml 10%酵母粉，0.25 mL 20%葡萄糖，0.04 mL 1%水解酪
蛋白，0.2 mL 0.25%所需氨基酸，0.05 mL 0.1mol/L，CaCl2，1ml 25 mmol/L MgCl2，补充灭菌蒸馏水至
总体积 10 ml.
参考文献：
- Requirements for transformation in bacillus subtilis
- 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究
1.3.3 感受态制备方法
挑取一新鲜培养的枯草芽孢杆菌单菌落接种于2.5 mL GM I培养基中，30℃ 130-150 r/min振荡培养过夜；将过夜培养物按 10%接种量接种于 2.5mL新鲜的 GM I中，37℃ 200-230 r/min振荡培养 3.5h；再将培养物进行第二次传代，接种于 5 mL GM II培养基中，突变型菌株 DB1342和 WB800以 10%接种量进行第二次传代，野生型菌株 BS501a按 5%接种量进行第二次传代，37℃ 200-230 r/min振荡培养 90 min;；取 1mL培养物，5 000 r/min室温离心 5min，用 1/10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。
枯草芽孢杆菌质粒转化原理：一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下，细胞壁和细胞膜形成缺陷，使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内。
1.3.4 外源基因插入位点选择
当需要将外源基因整合到染色体中，基因位点的选择也是比较重要的，哪些没有经过验证的位点，插入或许会导致菌株的异常，因此，选择广泛报道的位点成为首要考虑的任务。
- lacA
The Bacillus subtilis lacA gene, coding for β-galactosidase, has been explored as a new site able to accept DNA sequences from nonreplicating delivery vectors.
文献：Development of a new integration site within the Bacillus subtilis chromosome and construction of compatible expression cassettes
- amyE
The amyE locus, coding for a nonessential a-amylase, is used in most cases for ectopic integration.
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2. 芽孢杆菌基础资料
2.1芽孢杆菌培养基的选择
常规制备枯草芽孢杆菌感受态使用的培养基是LB 培养基，然而枯草芽孢杆菌在营养贫乏环境中容易产生芽孢，因此，不同的培养基会影响枯草芽孢杆菌感受态的形成。培养基YN 和MD 是实验室中常用的培养基，其营养成分比LB 丰富，而CDM 培养基是文献报道[16]可用来培养枯草芽孢杆菌的合成培养基，主要由无机盐组成，营养贫瘠。
研究发现，用YN 培养基制备的感受态效率是LB 培养基的4 倍左右，是MD 培养基的3–4 倍，而在CDM 培养基的转化效率最低，说明制备枯草芽孢杆菌的感受态需要营养丰富的培养基。
培养基：LB：10 g/L 氯化钠，5 g/L 酵母抽提物，10 g/L 蛋白胨。YN：7 g/L 酵母抽提物，18 g/L 营养肉汤。MD：7.5 g/L 酵母抽提物，8 g/L 营养肉汤。
注：检索不到作者指定的培养基名称！
文献：
- 枯草芽孢杆菌SCK6超级感受态的制备和转化条件优化
- Single,chemically defined sporulation medium for Bacillus subtilis: growth, sporulation, and extracellular protease production
2.2芽孢杆菌高频的基因
整理中……
2.3 双交换重组原理Double-crossover homologous recombination
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依赖枯草芽孢杆菌内源重组系统的策略
经典的染色体修饰是将选择标记（ 通常是药物抗性基因） 插入细菌染色体中。然而， 使用该策略再次对染色体修饰时需要引入第二种选择标记。因此可选用的标记基因的数量限制了对染色体的多次修饰。如果该菌株用于进一步的遗传操作， 需要通过单交换重组删除标记基因。此外， 该过程费时费力， 获得阳性突变体的概率低。
上游同源臂或者下游同源臂介导的单交换重组就可以将这个载体整合进入基因组的特定位置。
文献：Shi T, Wang GL, Wang ZW, Fu J, Chen T, Zhao XM (2013) Establishment of a
markerless mutation delivery system in Bacillus subtilis stimulated by a
double-strand break in the chromosome. PLoS ONE 8:e81370
同源重组敲除基因原理及方法
基因敲除|利用同源重组进行基因敲除的原理你真的知道吗？
2.4 多聚体质粒制备
多聚体质粒multirneric plasmid，比同一种质粒的多个单体分子结合而成的化合物，其分子量多倍于单体质粒的分子量。在质粒生产中，还存在一些复杂的、分子量更大的杂质，即质粒二聚体或多聚体。
-
多聚体质粒制备流程
文献：Transformation of Bacillus subtilis
2.5 大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体汇总
E. coli–B. subtilis shuttle vector pHT01
E. coli/B. subtilis shuttle plasmid pMA5
E. coli–B. subtilis shuttle vector pMK4
E. coli–B. subtilis shuttle vector PHY300PLK
E. coli–B. subtilis shuttle vector pAX01
temperature-sensitive E. coli-Bacillus shuttle vector pNZT1
序列在专利：一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用
穿梭载体：,Thermosensitive plasmid PNZT1
在不高于30℃的培养条件下， 该载体能在大肠杆菌和芽孢杆菌中自主复制。
https://bgsc.org/getdetail.php?bgscid=ECE356
2.6 抗生素中英对照
| 简写 | 英文 | 中文 |
|---|---|---|
| Amp | Ampicillin | 苄青霉素 |
| Cat | Chloramphenicol | 氯霉素 |
| Erm | Erythromycin | 红霉素 |
| Spc | Spectinomycin | 壮观霉素 |
| Tet | Tetracycline | 四环素 |
| Kan | Kanamycin | 卡那霉素 |
| Gen | Gentamicin | 庆大霉素 |
| Blast | ： | |
| Hyg | ： | |
| Ery | ： | |
| Neo | neomycin | 新霉素抗性基因 |
| Zeo | ： | |
| Neo/418 | ： |
2.7 可供参考的菌种数据库
国内：CICC, China Center of Industrial Culture Collection (http://www.chinacicc.org)
国际：BGSC, Bacillus Genetic Stock Center (Ohio State University, USA)
2.8 其他碎片化知识
Para, arabinose-inducible promoter of ara operon;
araR, arabinose operon transcriptional repressor of B. subtilis.
ColE质粒是一种编码大肠杆菌素的质粒。大肠杆菌素是一种细菌蛋白，可以杀死近缘且不含ColE质粒的菌株，而对宿主细菌无害。
Dam−：Dam甲基化（Dam methylation）缺失突变体，Trans5α 是常用的克隆菌株，是Dam+宿主，可以对转入其中的质粒或基因片段甲基化。
参考文献：质粒多聚体Plasmid Multimers的形成机制、检测方法及降低策略
常见抗性筛选浓度、原理及抗性基因序列
sfGFP
发现stationary phase promoter启动子
文献：Identification of a highly efficient stationary phase promoter in Bacillus subtilis
进一步优化了promoter Pylb启动子，使其表达的含量是wt的26倍：文献：Promoter engineering enables overproduction of foreign proteins from a single copy expression cassette in Bacillus subtilis
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